Isolement des artérioles rétiniennes Ex Vivo études de physiologie cellulaire

Toutes les expériences décrites ici ont été réalisés conformément aux directives figurant dans la Loi sur les animaux UK (procédures scientifiques) de 1986 et ont été approuvées par la Reine bien-être Animal de l’Université de Belfast et organe d’examen éthique. 1. isolement des artérioles rétiniennes Remarque : Le protocole suivant est utilisé pour isoler les artérioles rétiniennes. Cette méthode est optimisée pour les artérioles rétiniennes de rat, mais peut être utilisée avec la rétine de souris. Cependant, le rendement des vaisseaux, est inférieur lorsque vous utilisez la souris. Constituent une solution de faible Ca2 + contenant Hanks (LCH), comme illustré dans le tableau 1.NOTE : Cette solution peut être conservée pendant 3 jours à 4 ° C (lorsque stockées au format LCH, s’assurer qu’il s’équilibre à la température ambiante et le pH est correct avant de l’utiliser). Assembler les équipements suivants ayant précédé le prélèvement de tissu pour s’assurer de microdissection rapide de la rétine : dentelée, pinces, ciseaux courbes, lame plat (revêtement silicone Pétri), unique bordée de dissection, 2 séries de (blunt) 1 verre pince pipette Pasteur (feu poli d’un embout lisse mais pas étroit), 1 pipette en plastique jetable (avec pointe paré pour augmenter l’ouverture à ~ 5-7 mm), 1 verre rond bas tube à essai (5 mL) et le titulaire. Décanter environ 50 mL de la LCH dans un bécher de verre et de préparer un deuxième bécher de décanter les déchets liquides.Remarque : Consultez la Table des matières pour les spécifications et Détails du fabricant. Euthanasier le rat à l’aide de CO2 , puis par ponction cardiaque à exsanguinate (éviter la dislocation cervicale ou une commotion cérébrale car il peuvent endommager les vaisseaux sanguins dans le œil). Rétraction des paupières avec une pince dentelée, puis utilisez les ciseaux courbes pour couper autour des muscles orbitaux et par l’intermédiaire du nerf optique. Extraire doucement les yeux de l’orbite en prenant soin de couper à travers toutes les pièces jointes restantes avec des ciseaux. Placer les yeux plongés dans la solution de LCH sur le plat de dissection (yeux peut être transportés sur la glace dans une solution de LCH si nécessaire). Utilisez un jeu de pinces émoussé pour ancrer l’yeux sur le plat en maintenant les attaches musculaires orbitale ou le nerf optique ; Assurez-vous que le point d’ancrage est aussi proche que possible de la sclère pour stabiliser le œil. Avec la lame, coupez à travers la cornée le long de l’ ora serrata et retirez la lentille en appuyant doucement sur la sclère avec une pince. Couper les bonnettes en deux symétriquement par l’intermédiaire du disque optique. À l’aide de fermé pince doucement « brosse » sur les rétines depuis les deux moitiés de le œilleton en prenant soin d’enlever toutes les pièces jointes restantes au disque optique. Répétez l’opération avec le deuxième œil et transférer les rétines disséqués dans le tube à essai à l’aide de la pipette en plastique et une petite goutte de milieu de LCH. À l’aide de la pipette en plastique remplir le tube à essai avec LCH à ~ 5 mL et permettre les rétines se déposer au fond. Laver le tissu environ 3 fois, en enlevant ~ 4 mL de solution à partir du tube et en ajoutant des frais LCH à l’aide de la pipette en plastique. Le cas échéant, supprimer les tissus étrangers tels que les ligaments suspenseurs, de vitré et de poils. Lavez l’intérieur de la pipette Pasteur en verre (pointe polie) avec LCH pour empêcher le tissu de coller à la pipette. Utiliser la même pipette retirer environ 4 mL de solution de l’éprouvette. Ajoutez ensuite environ 2 mL de frais LCH. Doucement se dissocier (broyer) les rétines en dessinant le tissu par l’intermédiaire de la pointe du verre Pipetter lentement et expulsez le contenu dans le tube à essai. Remarque, essayez de ne pas introduire des bulles à cette étape. Répétez l’étape 1.10 jusqu’à ce que la rétine est cassée vers le haut à une taille d’environ 2-3 mm2. Lavez l’intérieur de la pipette avec environ 2 mL de LCH et expulsez cela dans le tube à essai. Laisser le contenu s’installer vers le bas pendant 5-10 min. Répéter le processus de trituration décrit dans 1.10-1.12 avec un peu plus de force, jusqu’à ce que les morceaux de tissu sont d’environ 1 mm2 en taille. Encore une fois, laissez le tissu se contenter de 5-10 min. Répétez les étapes 1.10-1.12 une troisième fois avec plus de force jusqu’à ce que le contenu est entièrement homogénéisé et ne restent aucuns morceaux de la rétine (la solution doit devenir laiteuse en apparence).NOTE : Cette technique permettra d’obtenir jusqu’à 8 segments d’arteriolare (relativement libres d’entourant neuropile et avec quelques branches demeurent intactes) par isolement mesure 8-45 µm de diamètre et 200-2500 µm de longueur. Transférer une petite quantité de l’échantillon isolé dans une chambre d’enregistrement physiologiques ou ajouter des colorants fluorescents pour la mesure de la concentration intracellulaire de Ca2 + ([Ca2 +]i; Voir la section 3). Disposer des restes de le œilleton et solution supprimées lors du processus d’isolement selon les règles locales sur le traitement des déchets d’origine animale.Remarque : Il est conseillé d’expérimenter sur les bateaux immédiatement après l’isolement, isolat excédentaire peut être stocké à 4 ° C pendant 8 h. 2. artériolaire pression myographie NOTE : La pression artériolaire myographie s’effectue comme suit en utilisant les équipements décrits dans la Figure 1 a, B et la Table des matières. Une prise aliquote d’homogénat de vaisseaux rétiniens (1 à 2 mL ; isolé conformément à l’article 1) à une chambre d’enregistrement physiologiques (partiellement rempli de nominalement solution Ca2 +gratuit Hanks ; 0Ca2 + Hanks’; voir tableau 1) monté sur la scène d’un microscope inversé. Laissez les vaisseaux à se déposent au fond de la chambre d’enregistrement pendant au moins 5 min avant l’expérimentation. Balayer visuellement la chambre d’enregistrement pour identifier les artérioles > 200 µm de longueur et qui possèdent une extrémité ouverte à travers laquelle le bateau peut être canulé (identification du type de navire est approfondie dans la section résultats). Positionner le navire au centre du champ de vision. Si aucun des navires adaptés ne sont présents, transférer une autre partie aliquote de l’homogénat de navire dans la chambre d’enregistrement selon l’étape 2.1. Fixer une extrémité du navire à l’aide d’une pince fine et un feuillet de fil de tungstène petit (75 µm de diamètre et ~ 2-4 mm de longueur) placé sur le navire (voir la Figure 1(i)). Pour ce faire tenir le fil dans la pince et placer la pince audessus de la chambre d’enregistrement. Identifier l’ombre correspondante de la pince sous le microscope, abaissez la pince dans le bain jusqu’à ce que le fil devient apparent. Positionner le fil sur le µm de bateau environ 200 de l’extrémité ouverte et déposez le fil perpendiculaire à l’axe longitudinal du navire.Remarque : Le poids du fil tungstène est suffisant pour bloquer le navire distalement arrêter flux de contenu luminal pendant la canulation et pressurisation. Déplacer l’artériole dans une position appropriée au sein de la chambre d’enregistrement, telle qu’elle se trouve horizontalement à travers le bain avec l’extrémité ouverte conformément à la canule de pressurisation (voir la Figure 1(ii-iv)). Le faire en poussant doucement le bordereau de fil de tungstène occlusion avec une section supplémentaire de fil qui s’est tenue au sein de la pince ; ne pas toucher l’artériole car il adhérera irréversiblement à la pince. Le cas échéant (pour les segments de l’artériole long), ajouter feuillets de fil de tungstène supplémentaire sur le navire tel que la distance entre les extrémités occluses et ouvertes du navire est pas plus de 200 µm ; Cela aide à prévenir l’artériole déplacement hors du champ de vision à la pressurisation. Si le bateau a des branches latérales, ceux-ci devraient également être obstrués par bordereaux de fil de tungstène supplémentaire. Si une branche latérale ne peut pas être obstruée, jeter le navire. Perfuse la chambre avec 0Ca2 + Hanks à 37 ° C pour enlever les tissus rétiniens superflues et pour chauffer le bain à une température physiologique.NOTE : Un système de chauffage standard bain gravitaire perfusion et en ligne peut être utilisé à cet effet (voir Figure 1 a). 0Ca2 + Hanks’ est utilisé pour faciliter la procédure de canulation, depuis le retrait de l’autorité de certification externe2 + veille à ce que les artérioles restent dilatées. Fabriquer des canules de pressurisation de le verre borosilicaté capillaires (embout diamètre ~ 3 à 10 µm selon le diamètre du vaisseau à être canulé ; petits navires nécessitent des canules plus restreint ; Voir la Table des matières) en utilisant un extracteur de microélectrodes et remblayer avec une solution 0Ca2 + Hanks. S’assurer que la tige de la canule est conique doucement vers l’extrémité pour faciliter la canulation. Monter la canule dans un porte-pipette jointe à une seringue de 10 mL via un connecteur en Y et un robinet 3 voies ; Cela sert à pressuriser le système, la pression étant enregistrées à l’aide d’un manomètre attaché à l’autre côté-bras du connecteur en Y (voir Figure 1 b).Remarque : Une pipette de « helper » est nécessaire pour aider au processus de canulation. Fabriquer la pipette dans un capillaire de verre borosilicate a tiré sur un extracteur microélectrode à un diamètre de 0,5 – 2 µm. fortement feu polonais la pipette (souvent jusqu’à la fermeture) en utilisant une microforge. Placez soigneusement la pipette d’assistance perpendiculairement à l’axe du navire près de l’extrémité ouverte à l’aide d’un manipulateur mécanique 3 axes (voir Figure 1). Placez la pipette d’assistance juste au-dessus du navire, mais ne pas toucher elle. Placez la pipette de la canule à l’extrémité ouverte du bateau (voir Figure 1 et 2 a(i)) à l’aide d’un micromanipulateur fin ; Positionner la pointe immédiatement adjacente à l’ouverture, tel qu’évalué en ajustant le plan de mise au point sur le microscope (à 20 X). Quand les deux extrémités du navire et l’extrémité de la canule sont en discussion en même temps la canule est bien positionnée pour cannulation (voir la Figure 2 a(ii)). La canule de pressurisation s’avancer dans l’ouverture du navire en utilisant les contrôles de l’axe des abscisses de la fin micromanipulateur (voir la Figure 2 a(iii)). Évaluer le succès de canulation en déplaçant la canule le long de l’axe des ordonnées. Si la canule reste à bord du navire, c’est avec succès canulée (voir Figure 2 a(iv)). Si la canule se déplace à l’extérieur du navire, la canule est susceptible d’être au-dessus du navire ; dans l’affirmative, répétez étape 2.10-2.11 avec la canule à un plan inférieur dans l’axe z. Après canulation réussie doucement la pipette d’assistance sur le navire pour retenir l’artériole. Guider la paroi artériolaire sur la canule de pressurisation avec la pipette d’assistance, en même temps que la pipette de canulation est avancée davantage dans la lumière du vaisseau à une distance d’environ 30 à 50 µm (voir la Figure 2 a(v, vi)).Remarque : Cette procédure nécessite un mouvement simultané, contrôlé de deux manipulateurs (pipette d’assistance vers la canule, tandis que la canule s’installe dans la lumière du vaisseau) et nécessitera une vaste pratique d’atteindre un taux de réussite élevé. Mettre en place la solution bain Hanks normale contenant Ca2 + 2 mM (voir tableau 1) à 37 ° C. En règle générale, cela entraîne un léger rétrécissement de l’artériole et la formation d’un joint étanche autour de la canule de pressurisation. La pipette d’assistance peut alors être déplacée loin du navire. Permettre une fermeture hermétique à développer pendant 15 min. Voir le vaisseau en utilisant une caméra USB (et logiciel d’acquisition image) attaché au microscope et ajuster la mise au point pour maximiser le contraste entre les limites de navire et les espaces extérieurs et intraluminal (voir Figure 2 b). Image du navire à 0,5 – 5 images/s. Après 1 min d’enregistrement à 0 mm Hg, augmenter la pression intraluminale au niveau souhaité en fermant le robinet 3 voies, attaché à la canule de pressurisation (voir Figure 1 b) et appliquer une petite quantité de pression positive au système au moyen de la seringue. Observez la pression changent sur le manomètre.Remarque : La pression peut être ajoutée de façon pas sage à 100 mmHg ou une valeur par exemple 40 mmHg (se rapprochant la pression artériolaire rétinien en vivo)23. Le navire devrait rapidement dilater confirmant la canulation réussie. Veuillez noter que la vasoconstriction induite par la pression (c’est à dire, la réponse myogénique) développera par la suite sur une période de 15 min, mais à cause de la petite taille de ces navires, ce n’est pas forcément visuellement détectable. Surveillez attentivement le navire pendant la pressurisation initiale des fuites évidentes. Sources de fuite peuvent émaner de branches latérales clivées ou étanchéité insuffisante de la canule à l’intérieur de l’artériole. Attention contenu intraluminal quitter le navire. Des fuites plus petits, moins évidents peuvent apparaître au fil du temps comme une chute de pression sur le manomètre. Si possible, bloquer l’ouverture avec feuillets de fil de tungstène supplémentaire prenant soin de ne pas pour déranger la canule. Exclure les préparations avec de fuite évidente de l’analyse. Appliquer le médicament d’abluminally d’intérêt pour le navire avant ou après, pressurisation 15 min selon les objectifs de l’expérience (le premier permet des effets sur le développement du tonus myogénique à déterminer, tandis que ce dernier permet l’analyse des effets sur l’état d’équilibre tonus myogénique). Un système typique est illustré dans la Figure 3 a. Placer la prise de livraison perpendiculaire à la partie de bâtiment d’intérêt (comme illustré dans la Figure 1) à une distance ~ 500 µm loin du navire d’intérêt en prenant soin de s’assurer que la prise soit optimale obliques au superfuse entièrement la zone (voir Figure 3 b). S’assurer que les changements en perfusion ne dérangent pas physiquement le navire. À l’issue d’une expérience, appliquer une solution de 0Ca2 + Hanks’ contenant 10 µM wortmannin (inhibiteur de kinase de la chaîne légère de la myosine) pour dilater au maximum le navire afin de déterminer le diamètre passif.Remarque : La résistance du joint canulation peut être testée à l’issue de l’expérience en augmentant la pression intraluminale à > 100 mm Hg. La majorité des bateaux resteront annexée même à cette haute pression, ce qui indique une bonne étanchéité. Effectuer des analyses hors ligne à l’aide de détection de bord pour suivre les changements dans le diamètre artériolaire (voir Table des matières pour le logiciel suggéré). Normaliser le diamètre de l’artériole au diamètre passif aux fins de comparaison entre les navires. 3. Ca2 + imagerie Remarque : Les artérioles rétiniennes isolés sont préparés pour conventionnel (microfluorimétrie) et confocale Ca2 + imagerie comme suit (en utilisant les équipements décrits dans la Table des matières). Préparer des homogénats rétiniennes dans une éprouvette de verre de 5 mL tel que décrit à l’article 1. Ajouter à 1 mL d’homogénat rétinienne Fura-02:00 (microfluormetric Ca2 + enregistrement) ou Fluo-04:00 (Ca2 + l’imagerie confocale) pour donner une concentration finale de 5 µM (protéger de la lumière) ; indicateurs de colorant chargent préférentiellement dans les cellules musculaires lisses. Conserver à température ambiante dans l’obscurité pendant 2 h en effleurant la paroi du tube toutes les 15-20 minutes pour remettre en suspension le tissu rétinien. Par la suite, diluer l’homogénat 1:4 avec la solution de la LCH à réduire encore les colorant de chargement.NOTE : Navires restent viables pendant 6 h (lorsqu’il est conservé à 4 ° C et dans le noir) ; Toutefois, il est recommandé que les expériences sont lancées dès que possible pour réduire l’impact de la compartimentation du colorant dans les organites internes ou extrusion du colorant au fil du temps. Transfert en 1 à 2 mL d’homogénat rétinienne à une chambre d’enregistrement à fond de verre (partiellement remplie de LCH) montée sur la scène d’un microscope inversé Ca2 + microfluorimétrie ou au système de microscopie confocale. Artérioles perpendiculaires à la direction du flux d’ancrage dans l’ensemble de la chambre d’enregistrement, avec feuillets de fil de tungstène (50 µm de diamètre, 2-4 mm de longueur) espacée de ~ 100-200 µm le long de la longueur du bateau (voir Figure 3) à l’aide d’une technique similaire à celle décrite à l’étape 2.3. Perfuse le bain avec une solution normale Ca2 + Hanks à 37 ° C. Positionner la prise de livraison de drogue comme illustré sur la Figure 3 et appliquer des médicaments aux bateaux comme indiqué au point 2.17. Pour classiques Ca2 + imagerie, éclairer le navire à 340/380 nm via un objectif à immersion d’UV huile (par exemple, 100 X, NA 1.3) et recueillir la fluorescence émise à 510 nm via un photon counting tube photomultiplicateur (PMT). À la fin de chaque expérience, mesurer la fluorescence de fond par trempe navire avec une solution contenant MnCl (voir tableau 1). Utiliser des ratios de la fluorescence de fond corrigée (R-F340/F380) pour analyse ou convertir en intracellulaire Ca2 + ([Ca2 +]i) à l’aide de Rmin et mesuresmax R (voir tableau 1, appliqué avant la trempe 24) et l’ équation de Grynkiewicz25. Pour l’imagerie2 + Ca confocale, exciter Fluo-4 chargés de navires à 488 nm et capture les émissions qui en résultent de fluorescence à 490-535 nm dans chaque ligne scan (xt) ou les modes de balayage xyt (512 x 512 pixels ; sténopé suggérée 300 nm). Normaliser les mesures de la fluorescence enregistré au temps t = 0 s (F/F0). Évaluer toute modification [Ca2 +]i au cours des médicaments, des demandes ou pressurisation en mode hors connexion dans des régions spécifiques d’intérêt (ROIs) en utilisant le logiciel d’analyse image. Si nécessaire, allez Ca2 + imagerie avec pression myographie.NOTE : Les descriptions ci-dessus ont été optimisées pour les navires non pressurisés ; Toutefois, il est possible de combiner Ca2 + imagerie avec pression myographie comme suit. Isoler les artérioles conformément à l’article 1. Charger avec Ca2 + indicateur colorants comme par l’Etape 3.1 ou 3.2. Transférer les artérioles dans la chambre d’enregistrement et Cathétériser conformément à l’article 2. Prenez soin de limiter l’exposition à la lumière pendant la procédure de montage. Mesurer Ca2 + selon étape 3.5 ou 3.7 ci-dessus. Pressurisez le navire et recommencez la mesure de Ca2 +. Mesure simultanée du diamètre des vaisseaux est tributaire de la mode de Ca2 + mesure et équipements utilisés.Remarque : Pour confocal Ca2 + mesure il peut être nécessaire à l’image des régions séparées avant et après pressurisation en raison de la décoloration du colorant au cours de longues expositions à la lumière. 4. Patch-Clamp électrophysiologie Remarque : Enregistrement cellule entière et monocanal est possible le muscle lisse artériolaire individuels cellules encore intégrés dans leurs artérioles parent comme suit (en utilisant les équipements décrits dans la Table des matières). Isoler et ancrer des artérioles rétiniennes dans la chambre d’enregistrement, comme décrit aux étapes 1, 2.3 et 3.3. Pour enregistrement de patch-clamp, le fil de tungstène feuillets sont espacés de 200 à 800 µm apart le long du vaisseau. Retirez la lame basale qui entoure l’artériole et débrancher électriquement adjacentes fibres musculaires lisses et les cellules endothéliales sous-jacent avant serrage patch. Pour ce faire, superfuse le bateau avec une série séquentielle de solutions enzymatiques (tableau 1) à 37 ° C pour la durée désirée.Remarque : La durée de l’exposition de l’enzyme est optimisée pour les artérioles rétiniennes de rat (protéase, ~ 8 min ; collagénase, ~ 12 min) et dépend de la vitesse d’écoulement de la drogue du système (~ 1 mL/min sur notre set-up) et les activités de l’unité du lot des enzymes utilisés. Évaluer le niveau de la digestion sur espacement visuel d’endothéliale et couches de muscle lisse au cours de la collagénase étape tel qu’illustré à la Figure 4. Une fois que la séparation des couches cellulaires est observée (comme illustré à la Figure 4 b), appliquer la DNAse j’ai solution (~ 4 min) puis terminer la digestion en remplacement de la solution de salle de bain avec une solution normale Ca2 + Hanks. Supprimer n’importe quelle fibre restante de la lame basale et/ou périphérique neuropile en balayant soigneusement l’extrémité fermée des pinces fines le long de la surface du navire. Tirez et polir capillaires en verre (Table des matières), remplir avec la solution de la pipette (tableau 1) et placez le titulaire de la pipette de la tête de patch clamp. Placez la pipette à un angle de 45° par rapport à la chambre d’enregistrement et le faire avancer vers le vaisseau en utilisant le réglage grossier sur un micromanipulateur motorisé. Sélectionnez une cellule musculaire lisse qui dépassent de la paroi des vaisseaux et dont la surface est exempte de débris visibles (voir Figure 4 b). Placer l’embout de la pipette verticalement sur la cellule d’intérêt et abaisser progressivement en utilisant le mouvement amende/lent de la micromanipulateur pour faire contact avec la membrane du muscle lisse. Évaluer le contact entre la cellule et pipette visuellement du mouvement cellulaire et un changement dans la pipette de résistance mesurée en utilisant le protocole d’essai de membrane (sceau) dans le logiciel d’acquisition (5 à 10 mV négatif pas de 0 mV, fréquence 25 KHz ; voir Figure 5 a(i)) . Lorsque la résistance du joint a augmenté de 5 fois (par exemple, passant de 2 à 10 MΩ ; Figure 5 a (ii)) appliquer transitoirement une pression négative à l’arrière du porte-pipette via un connecteur en y, robinet 3 voies, la seringue et tuyau attaché au titulaire de la pipette (assemblés de manière similaire à celle utilisée en phase de pressurisation des artérioles, voir Figure 1 b). Répéter les applications de pression négative jusqu’à une gigaseal (> 1 résistance GΩ ; comme indiqué par le test de la membrane dans le logiciel d’acquisition) est formé (Figure 5 a(iii)). Noter que ce processus peut prendre de 1 à 5 min. Si un gigaseal ne parvient pas à se former, choisir une autre cellule à l’aide d’une pipette de frais patch patch clamp de. Appliquer un potentiel de maintien à la cellule via le logiciel d’acquisition selon l’expérience en cours (généralement 0, -40 ou -80 mV). Étudier l’activité monocanal (sur cellules) dans la configuration actuelle. Vous pouvez également générer patches dedans-dehors en rétractant rapidement la pipette de la surface cellulaire après la formation de gigaseal. Comme les extrémités libres de la membrane peuvent re-recuire dans ces conditions, retirer la pipette du bain par un mouvement vertical rapide du manipulateur (réglage grossier). Retourner rapidement à travers le ménisque pour enlever la membrane réformée, laissant seulement le patch à l’intérieur de l’embout de la pipette. Définissez la fréquence d’échantillonnage sur le logiciel d’acquisition à 5 KHz et activer le mode d’enregistrement continu pour l’activité record. Appliquer les modifications de tensions si nécessaire via le logiciel ou de l’amplificateur. Si nécessaire, appliquer médicaments à patch navire/membrane comme indiqué au point 2.17. Si le tronçon de membranes est nécessaire, appliquer une pression négative à l’extrémité postérieure de la pipette à l’aide de la seringue jointe à un manomètre via un robinet 3 voies et un raccord en y. Analyser les enregistrements monocanal pour la probabilité d’ouverture et de la conductance unitaire conformément aux procédures standard26. Pour toute cellule actuelle enregistrement pipettes pull et polonais selon la Table des matières, remplir avec la solution de la pipette contenant l’amphotéricine B (ajouter 3 mg d’amphotéricine B à 50 µL de DMSO ; ajouter 3-6 µL de cela dans 1 mL de solution de la cellule entière pipette soniquer pour mélanger) et former un joint comme par les Etapes 4.6 à 4.9. En raison de l’inclusion de l’amphotéricine B il n’y a aucune nécessité à la rupture de la membrane dans l’embout de la pipette pour accéder à germes entiers. Surveiller l’accès, qui sera gagné peu à peu, en utilisant le protocole d’essai de membrane dans le logiciel d’acquisition (étape mV-20 de -40 mV, fréquence d’échantillonnage 25KHz ; voir Figure 5 b). Montage automatisé de capacitifs transitoires dans certains logiciels conduit à des mesures en temps réel d’accès résistance et capacité de cellule (sinon le déclin relatif des transitoires peut être évalué par œil). Une fois que la résistance d’accès tombe à 15 < MΩ, effectuer des compensations de résistance série (Figure 5) aide des cadrans de paramètre de germes entiers (résistance série et la capacité) de l’amplificateur. Pour ce faire, les valeurs de montage automatisé permet de définir au départ les cadrans (voir la Figure 5(ii)), puis augmentez la molette de correction de résistance série (prévision et correction si elle est disponible sur l’amplificateur) ré-ajuster les compensations de cellules entières tout en réduisant la couplage capacitive (voir la Figure 5(iii)). En prenant soin de ne pour plus compenser (comme illustré à la Figure 5(iv)). En règle générale, il est possible de compenser la résistance série de 75 % en mode patch perforé (requis en compensation de décalage d’être réglé à son maximum). Si aucun montage automatisé n’est disponible, commencez par paramètre, les paramètres de la cellule entière, cadrans à 15 pF et 15 mΩ (valeurs typiques pour ces cellules) et ajustez pour produire les résultats, comme le montre la Figure 5(ii). Augmentation de la rémunération de résistance série composer à ~ 75 % et réajuster les paramètres de la cellule entière cadrans selon la Figure 5(iii). Avant de commencer l’expérimentation noter la mesure de capacité cellulaire depuis le montage automatisé initial ou le cadran après compensation manuelle.Remarque : Cette valeur est utilisée pour normaliser les courants à la taille des cellules. Compensation pour la résistance série peut devoir être ajustée au cours de l’expérimentation, comme accès peuvent continuer à l’améliorer en raison davantage d’incorporation d’amphotéricine B dans le patch. Appliquent les médicaments aux navires comme indiqué au point 2.17. Appliquer des protocoles de tension (étapes ou rampes d’accès) selon les conditions expérimentales.NOTE : Protocoles de step tension typique, 0,1 – 1 s dans la durée, sont appliquées dans l’exploitation potentiel en 10-20 mV incrémente toutes les 5-10 s pour produire une famille de courants activés par tension. Également utiliser des protocoles de rampe pour mesurer les courants à une série de tensions dans un « sweep » par la montée en puissance lentement la tension (100-200 mV/s) de p. ex. -80 à + 80 mV (appliqué toutes les 5-10 s) avec un échantillonnage actuellement hors du courant à intervalles de 10 mV au cours de la rampe. Il est possible de combiner Ca2 + imagerie avec patch-clamp d’enregistrement comme suit. Isoler les artérioles conformément à l’article 1. Charger avec Ca2 + indicateur colorants selon les étapes 3.1 ou 3.2. Montez dans la chambre d’enregistrement conformément à l’article 4. Prenez soin de limiter l’exposition à la lumière au cours de ces procédures.Remarque : À ce jour il n’a pas été possible de combiner le patch clamp avec études myographie pression due à la perte de la membrane basale et l’intégrité du navire pendant le processus de dissociation enzymatique