Nous présentons un protocole pour la reversion chimique efficace, rapide et en vrac de classiques pluripotentes humaines lineage-amorcé des cellules souches (hPSC) dans un état de préimplantation épiblaste comme pluripotentes naïve epigenomically stable. Cette méthode se traduit par l’expression des gènes de lignée-amorcé une baisse et une amélioration marquée dans la différenciation multilignée dirigée à travers un vaste répertoire des lignes classiques hPSC.
Naïve des cellules souches pluripotentes humaines (N-hPSC) avec une fonctionnalité améliorée peut avoir un large impact en médecine régénérative. Le but du présent protocole est revenir efficacement les cellules souches pluripotentes humaines lineage-amorcé, conventionnel (hPSC) maintenus sous conditions soit sans chargeur ou alimentation dépendant à une pluripotence naïve comme avec une fonctionnalité améliorée. Cette méthode de réversion naïf chimique emploie le facteur inhibiteur de leucémie classique (LIF), GSK3β et MEK/ERK inhibition cocktail (FRV-2i), additionné de seulement un inhibiteur de la tankyrase XAV939 (LIF-3i). FRV-3i revient hPSC traditionnelle à un état stable pluripotentes adoptant biochimiques, transcription et des fonctionnalités épigénétiques de l’épiblaste avant l’implantation humaine. Cette méthode de FRV-3i nécessite la manipulation de la culture de cellule minimale et est hautement reproductible dans un vaste répertoire de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et des lignées de cellules souches (hiPSC) exempt de transgene humaines pluripotentes induites. La méthode FRV-3i ne nécessite pas une ré-amorçage étape avant la différenciation ; N-hPSC peuvent être différenciés directement avec des rendements très élevés et de maintenir caryotypique et épigénomique stabilités (y compris aux imprimés loci). Afin d’accroître l’universalité de la méthode, hPSC classique sont tout d’abord cultivé dans le cocktail de FRV-3i additionné de deux autres petites molécules qui potentialisent la protéine kinase A (la forskoline) et sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) signalisation (FRV-5i). Cette brève étape adaptation de FRV-5i considérablement améliore l’expansion clonale initiale des hPSC classique et leur permet d’être naïf-revenue par la suite avec FRV-3i seul en grandes quantités, ce qui éviterait la cueillette/subcloning rare N-hPSC colonies plus tard. HPSCs LIF-5i-stabilisé sont maintenus par la suite en FRV-3i seuls sans avoir besoin de molécules anti-apoptotiques. Plus important encore, réversion FRV-3i améliore nettement la pluripotence fonctionnelle d’un vaste répertoire de classique hPSC en diminuant leur expression de gène lineage-amorcé et effacement de la variabilité de l’interligne de différenciation dirigée communément observé parmi les lignes de hPSC indépendants. Caractérisations représentatives de N-hPSC LIF-3i-revenue sont stratégies fournis et expérimentales pour les comparaisons fonctionnelles de hPSC isogénique dans lineage-amorcé vs. naïve comme États sont décrits.
Le système de culture 2i (inhibiteur de la MEK/ERK et GSK3β) a été développé pour améliorer les cultures des cellules souches embryonnaires (mESC) hétérogènes axée sur le sérum de souris à un état fondamental uniform de pluripotence s’apparente à l’épiblaste préimplantatoire souris1. Cependant, 2i ne supporte pas le maintien stable de pluripotentes humaines les cellules souches (hPSC) lignes2. Les différents complexes petites molécules, additionné de facteur de croissance et les approches transgéniques ont récemment été rapportés pour capturer putativement similaires naïve comme pluripotentes moléculaire indique2. Toutefois, nombre d’Etats « naïve-like » a aussi créés avec ces méthodes exposées caryotypique instabilité, épigénomique défauts (par exemple, la perte globale de l’empreinte génomique parentale) ou affaiblies potentiel de différenciation.
En contraste, le cocktail de triple inhibition chimique de GSK3β, ERK et signalisation de la tankyrase et facteur inhibiteur de leucémie (LIF-3i) était suffisant pour que la réversion naïve comme stable d’un vaste répertoire de classiques hPSC lignes3. FRV-3i-revenue naïve hPSC (N-hPSC) maintenu caryotypes normaux et ont augmenté leurs expressions de gènes de l’épiblaste préimplantatoire humaine naïve spécifiques (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). FRV-3i reversion conférée aussi hPSC avec un éventail de caractéristiques moléculaires et biochimiques particulières à la pluripotence mESC comme naïve qui inclus STAT3 phosphorylée de signalisation accrue, diminution de la phosphorylation de ERK, global 5-méthylcytosine CpG l’hypométhylation, déméthylation CpG génome dans les cellules souches embryonnaires (CSE)-promoteurs de gènes spécifiques et l’utilisation dominante de renforceur du OCT4 distale. Par ailleurs, en comparaison avec d’autre naïve des méthodes de réversion qui ont abouti à aberrantly hypométhylés imprimé locus génomiques, N-hPSC LIF-3i-revenue étaient dépourvues de perte systématique d’imprimés motifs CpG ou d’expression de l’ADN méthyltransférase (par exemple, DNMT3B DNMT1, DNMT3A,)3.
Une culture de FRV-3i directe d’un large éventail de classiques cellules de souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSC) cultivées sur des mangeoires ou des conditions E8 chargeur atteint retour rapide et en vrac à un État épiblaste naïf. Toutefois, direct FRV-3i naïf reversion peut être inefficace dans certaines lignées hPSC classiques instable en raison les variabilités de génomiques et de la lignée-amorcé inhérentes découlant issus des milieux donneur génétiquement diversifiés.
Ainsi, pour accroître l’utilité de la méthode FRV-3i, une optimisation progressive a été développée et est présentée ici, qui permet de réversion naïf universel avec presque n’importe quel CSEh classique ou libres transgène hiPSC ligne cultivées sur les mangeoires. Cette méthode de réversion naïf universalisé emploie une étape transitoire culture initiale en hPSC classique qui complètent le cocktail FRV-3i avec deux autres petites molécules (FRV-5i) qui potentialisent la protéine kinase A (la forskoline) et sonic hedgehog (sHH) ( signalisation de Purmorphamine). Un passage initial de hPSC classique en FRV-5i adapte à ultérieure stable FRV-3i réversion en grandes quantités. Adaptation de FRV-5i initiale augmente significativement la prolifération clonale initiale seule cellule des hPSC classique cultivée sur E8 ou mangeoires (avant leur adoption subséquente de stable et continue en FRV-3i seul). Lignes hPSC conventionnel adaptés tout d’abord à un passage en FRV-5i tolèrent subséquentes en vrac clonale passage des naïfs-revenue des cellules dans des conditions de FRV-3i, qui élimine la nécessité pour la récolte et subcloning de rares colonies stables, ou l’utilisation systématique de molécules anti-apoptotiques ou inhibiteurs de protéine associée à Rho kinase (ROCK).
La méthode FRV-3i a été avec succès employée stablement développer et maintenir un vaste répertoire de > 30 lignes hPSC classiques indépendants et génétiquement diversifiée pour > 10 – 30 passages à l’aide de deux méthodes de dissociation non enzymatique ou enzymatique, et sans preuve d’induction de chromosomiques ou d’anomalies épigénomique, y compris les anomalies à l’imprimé locus. En outre, séquentiel FRV-5i/FRV-3i culture est la méthode la réversion seule naïve qui a jusqu’à présent été signalée qui améliore la pluripotence fonctionnelle d’un vaste répertoire des lignes conventionnelles hPSC en diminuant leur expression de gène lineage-amorcé et considérablement améliorer leur potentiel de différenciation multipotentes. Le FRV-3i naïf reversion méthode efface l’inhérente interligne de variabilité de la différenciation des lignes conventionnelles, apprêtée à la lignée hPSC et aura une grande utilité de l’application en médecine régénératrice et de thérapies cellulaires.
Le système de FRV-3i applique une version modifiée du classique 2i murine naïf reversion cocktail1 à cellules souches pluripotentes humaines. L’auto-renouvellement des hPSC (qui ne peut pas développer à 2i seul) est stabilisé en FRV-2i en complétant ce cocktail avec l’inhibiteur de la tankyrase XAV939. FRV-3i culture permet en vrac et efficace retour de la hPSC conventionnelle à un État pluripotentes ressemblant à l’ épiblaste préimplantatoire humain<sup c…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par des subventions de NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), le prix Innovation de BRP Stein, le Maryland Stem Cell Research Fund (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk Science Forum Award et la Fondation Moseley.
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated | BD Biosciences | 561716 | use 5µL per assay (FACS) |
anti- TFCP2L1 antibody | Sigma Aldrich | HPA029708 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
anti-beta-Actin antibody | Abcam | ab6276 | use at 1:5000 (Western blot) |
anti-CD146 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | use 5µL per assay (FACS) |
anti-CD31 antibody, APC conjugated | eBioscience | 17-0319-42 | use 2µL per assay (FACS) |
anti-CD31 microbead kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
anti-NANOG antibody | Abcam | ab109250 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
anti-NR5A2 antibody | Sigma Aldrich | HPA005455 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody | Cell Signaling | 4695 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody | Cell Signaling | 4370 | use at 1:1000 (Western blot) |
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody | Cell Signaling | 9145 | use at 1:1000 (Western blot) |
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated | Agilent | E0432 | use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated | R&D System | FAB1435A | use 5µL per assay (FACS) |
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated | R&D System | NLLC1435G | use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
anti-STAT3 antibody | Cell Signaling | 9139 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
anti-STELLA/DPPA3 antibody | Millipore | MAB4388 | use at a 1:50 dilution (immunostainings) |
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated | R&D System | NLLC4770R | use at a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0068 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0069 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560193 | use 10µL per assay (FACS) |
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560161 | use 10µL per assay (FACS) |
APEL2-Li | StemCell Technologies | 5271 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3311 | |
CellAdhere dilution buffer | StemCell Technologies | 7183 | dilutent for Vitronectin XF™ matrix |
CF1 mouse | Charles river | 023 | |
CHIR99021 | R&D System | L5283 | reconstitute at 100mM in DMSO |
confocal microscope system | Zeiss | LSM 510 | |
cord blood CD34+ derived iPSC line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | also referred as 6.2 line |
Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
Countess cell counting chamber slide | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650 | |
DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | |
Essential 8 (E8) medium | StemCell Technologies | 5940 | |
Fetal bovin serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | |
Forskolin | Stemgent | 04-0025 | reconstitute at 100mM in DMSO |
Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G1890-100G | resuspend in water and sterilize with an autoclave |
KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | |
L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
mTeSR1 medium | StemCell Technologies | 85850 | |
Nalgene cryogenic vials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Fisher Scientific | 154534 | |
Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
PD0325901 | Sigma Aldrich | PZ0162 | reconstitute at 100mM in DMSO |
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
Purmorphamine | Stemgent | 04-0009 | reconstitute at 10mM in DMSO |
recombinant human Activin A | Peprotech | AF-120-14E | |
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 | Peprotech | 120-05ET | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
recombinant human FGF-basic (bFGF) | Peprotech | 100-18B | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
recombinant human LIF | Peprotech | 300-05 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
SB431542 | Stemgent | 04-0010-05 | reconstitute at 100mM in DMSO |
Stemolecule Y27632 in Solution | Stemgent | 04-0012-02 | ROCK inhibitor in solution (10mM) |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A11105-01 | |
Streptavidin-Cy3 conjugate | Sigma Aldrich | S6402 | use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 | Peprotech | 100-21 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
Vitronectin XF matrix | StemCell Technologies | 7180 | dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer |
XAV939 | Sigma Aldrich | X3004 | reconstitute at 100mM in DMSO |
β-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | light sensitive |