胞内活性氧在细胞衰老诱导中起着重要作用。在这里, 我们描述了一个敏感的测定细胞衰老过程中的 ROS 水平。我们还提供了评估衰老相关分泌表型的协议, 据报告, 这有助于各种年龄相关的功能障碍。
细胞衰老被认为是一种不可逆的生长状态, 在衰竭的增生能力或接触到各种压力。最近的研究扩大了细胞衰老在各种生理过程中的作用, 包括发育, 伤口愈合, 免疫监测和年龄相关的组织功能障碍。虽然细胞周期骤停是细胞衰老的一个重要标志, 但增加的细胞内活性氧 (ROS) 的生产也被证明对细胞衰老的诱导起着重要作用。此外, 最近的研究表明衰老细胞通过衰老相关的分泌表型 (SASP) 在邻近细胞和组织中表现出强有力的分泌活动。对细胞衰老的治疗策略的兴趣急剧增加强调需要对衰老机制, 包括胞内活性氧和 SASP 进行精确的了解。在这里, 我们描述了用 ros 敏感荧光染料和流式细胞仪定量评估 h-Ras 诱导的细胞衰老过程中细胞内 ROS 含量的协议。此外, 我们还介绍了敏感技术, 以分析诱导的 mRNA 表达和分泌的 SASP 因素。这些协议可应用于各种细胞衰老模型。
50年前, 佛烈克和穆尔黑德发现, 正常细胞在细胞分裂1后, 在其增殖潜能耗尽后进入不可逆转的生长。这种现象现在被称为复制衰老, 并被认为与生物体衰老有强烈的关联2。虽然端粒的渐进侵蚀被认为是复制衰老的主要原因, 但据报道, 各种细胞应力, 如 DNA 损伤、致癌活化和氧化应激等, 都被报告诱发另一种细胞衰老。称为 “过早衰老” 或 “应力诱发衰老”。有趣的是, 过早衰老对肿瘤的激活起到了强有力的抑制作用, 如 H-Ras 和 BRAF。对小鼠模型和人体组织的研究已经产生了强有力的证据, 表明细胞衰老的生物标志物主要存在于前病变中, 在那里致癌 Ras 和 BRAF 被激活, 但在恶性癌症中被减少, 从这些病变3,4,5。除了它在衰老和肿瘤抑制方面的作用, 细胞衰老已经在以前的研究中显示, 在各种生理过程中发挥作用, 包括伤口愈合, 组织修复, 免疫监测, 胚胎发育6。
尽管生长骤停已被广泛研究为7细胞衰老的标志, 但大量的证据表明胞内活性氧 (ROS) 也有助于细胞衰老8。在不同类型的细胞衰老过程中, ROS 水平的升高, 包括复制衰老和癌基因引起的衰老, 最初是在数十年前的9,10。一个更直接, 外源治疗与致死剂量的 H2O2诱导衰老11,12。抑制 ROS 清除酶, 如 SOD1, 也导致过早衰老13。相比之下, 低环境氧条件和增加 ROS 清除延缓衰老的开始10,14,15。这些结果无疑表明, ROS 是细胞衰老诱导的重要调解人或决定因素。然而, ros 是如何促进细胞衰老的诱导以及在细胞衰老过程中 ros 水平的升高需要进一步的研究。
最近的研究表明, 衰老细胞通过 SASP16、17, 在邻近细胞和组织中具有强大的分泌活性。在衰老的组织中, 衰老细胞通过 SASP 的多种途径促进与年龄相关的组织功能障碍, 除了对增生细胞的自主耗尽之外。衰老细胞分泌的各种促炎因子, 如 IL-6、IL-8、TGFβ和基质金属蛋白酶 (金属蛋白酶), 通过组织稳态的损伤、组织结构的破坏, 引起与年龄相关的组织功能障碍,邻近细胞衰老, 无菌炎症18,19。然而, SASPs 可以产生有益的影响, 取决于生物环境。此外, SASPs 的 heterogenetic 性质取决于衰老细胞类型和细胞阶段, 强调需要进一步研究19。
在这里, 我们描述了快速和灵敏的细胞技术, 以评估细胞内活性氧的水平。此外, 还介绍了利用定量实时聚合酶链反应 (qPCR) 和 ELISA 法分析 SASP 因子的方法。
在这里, 我们提出了监测 WI-38 正常人成纤维细胞在 H-Ras 诱导衰老过程中胞内活性氧水平的方法。用细胞渗透性试剂 DCF-DA 和流式细胞仪定量测定活细胞内的活性氧水平。细胞吸收后, 脱乙酰度细胞内酯, 然后由 ROS 氧化, 形成高度荧光 2 ‘, 7 ‘-dichlorofluorescein (dcf)。用 FL1 检测器 (绿色荧光) 检测流式细胞仪可以探测到 DCF 荧光。利用 DCF-DA 染色法, 成功检测了 WI-38 正常人成纤维细胞在 H-Ras 诱导的细胞衰?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了韩国国家研究基金会 (2015R1D1A1A01060839) 和韩国政府 (NRF) 资助的韩国国家研究基金会 (MSIT) 的资助 (不 2016R1A2B2008887, 不。2016R1A5A2007009) (Jeanho 云)。
REAGENTS | |||
poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
BOSC 23 | ATCC | CRL-11269 | |
FBS | GIBCO | 16000-044 | |
penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
pBabe puro-H-RasV12 | Addgene | 1768 | |
pGAG/pol | Addgene | 14887 | |
pVSVG | Addgene | 1733 | |
Turbofect | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma-Aldrich | B4252 | |
potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | B4252 | |
potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
DCF-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | 10 mM |
Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
MMLV Reverse transcriptase | Promega | M1701 | |
SYBR Green PCR master 2X mix | Takara | PR820A | |
Random Primer | Promega | C118A | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
Human IL-6 ELISA assay | PeproTech | #900-TM16 | |
Human IL-8 ELISA assay | PeproTech | #900_TM18 | |
EQUIPMENTS | |||
0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
Parafilm | BEMIS | PM-996 | |
Microscope | NIKON | TS100 | |
Flow cytometer | BD Bioscience | LSR Fortessa | |
Amicon Ultra-4ml | Merk Millipore | UFC800324 | |
NanoDrop spectrophotometer | BioDrop | 80-3006-61 | |
Real-time PCR System | Applied Biosystems | ABI Prism 7500 | |
ELISA Reader | Molecular Devices | EMax microplate reader |