Une mesure Quantitative des espèces réactives de l’oxygène et phénotype sécrétoire associée à la sénescence dans des fibroblastes humains normaux pendant la sénescence induite par l’oncogène
Summary
ROS intracellulaire a été démontré à jouer un rôle important dans l’induction de la sénescence cellulaire. Nous décrivons ici une analyse sensible pour quantifier les niveaux ROS au cours de la sénescence cellulaire. Nous fournissons également des protocoles d’évaluation le phénotype sécrétoire associée à la sénescence, qui aurait été contribue à diverses dysfonctions liées à l’âge.
Abstract
Sénescence cellulaire a été considérée comme un état d’arrêt de la croissance irréversible après épuisement des capacité proliférative ou l’exposition à divers stress. Des études récentes ont élargi le rôle de la sénescence cellulaire à divers processus physiologiques, y compris le développement, la cicatrisation des plaies, surveillance du système immunitaire et dysfonction liée à l’âge des tissus. Bien que l’arrêt du cycle cellulaire est une caractéristique essentielle de la sénescence cellulaire, la production d’une augmentation intracellulaire réactives de l’oxygène (DRO) a aussi démontrée à jouer un rôle important dans l’induction de la sénescence cellulaire. En outre, des études récentes ont révélé que les cellules sénescentes ont activités paracrine puissants voisins des cellules et des tissus par un phénotype sécrétoire associée à la sénescence (SASP). La forte augmentation de l’intérêt au sujet des stratégies thérapeutiques contre la sénescence cellulaire met l’accent sur la nécessité d’une compréhension fine des mécanismes de la sénescence, y compris les ROS intracellulaire et la SASP. Nous décrivons ici les protocoles pour évaluer quantitativement les niveaux intracellulaires de ROS au cours de la sénescence cellulaire induite par H-Ras à l’aide de colorant fluorescent ROS-sensible et cytométrie en flux. En outre, nous introduisons des techniques sensibles pour l’analyse de l’induction de l’expression de l’ARNm et la sécrétion des facteurs de la SASP. Ces protocoles peuvent être appliqués aux divers modèles de sénescence cellulaire.
Introduction
Plus de 50 ans, Hayflick et Moorhead a révélé que les cellules normales entrent dans l’arrestation de croissance irréversible sur l’épuisement de leur potentiel prolifératif après un certain nombre de divisions cellulaires1. Ce phénomène est maintenant connu comme la sénescence réplicative et croit fortement en corrélation avec le vieillissement organismique2. Bien que l’érosion progressive des télomères est considéré comme une cause majeure de la sénescence réplicative, divers stress cellulaires, tels que des dommages ADN, l’activation oncogène et le stress oxydatif, ont été signalés à induire un autre type de sénescence cellulaire appelé « sénescence prématurée » ou « sénescence induite par le stress ». Fait intéressant, la sénescence prématurée joue un rôle de tumeur comprimant puissant lors de l’activation d’oncogènes tels que H-Ras et BRAF. Des études de modèles murins et tissus humains ont donné des preuves solides que les biomarqueurs de la sénescence cellulaire ont été principalement présents dans les lésions précancéreuses où oncogène Ras et BRAF sont activées mais ont diminué dans les cancers malins qui élaborés à partir ces lésions3,4,5. Au-delà de son rôle dans le vieillissement et la suppression tumorale, sénescence cellulaire a été démontrée dans des études antérieures à jouer un rôle dans divers processus physiologiques, notamment la cicatrisation des plaies, la réparation des tissus, surveillance immunitaire et développement embryonnaire6.
Bien que l’arrêt de la croissance a été particulièrement étudié comme une caractéristique de la sénescence cellulaire7, un nombre significatif de preuves suggère que les espèces réactives intracellulaire de l’oxygène (ROS) contribuent également à la sénescence cellulaire8. L’élévation des niveaux ROS au cours de différents types de sénescence cellulaire, y compris la sénescence réplicative et la sénescence induite par l’oncogène (OIS), a été rapportée à l’origine des décennies il y a9,10. Plus directement, au traitement exogène avec une dose sublétale de H2O2 induit la sénescence11,12. L’inhibition des enzymes ROS-nettoyage, comme la SOD1, provoque également la sénescence prématurée13. En revanche, faible oxygène ambiant et augmentant retard antiradicalaire ROS le début de la sénescence10,14,15. Sans aucun doute, ces résultats indiquent que les ROS sont des médiateurs importants ou des déterminants de l’induction de la sénescence cellulaire. Cependant, comment ROS contribuent à l’induction de la sénescence cellulaire et comment ROS taux sont élevés au cours de la sénescence cellulaire doivent être enquête.
Études récentes ont révélé que les cellules sénescentes ont puissant paracrine activités sur les voisins des cellules et des tissus à travers une SASP16,17. Dans les tissus âgés, cellules sénescentes promouvoir des dysfonctionnements liés à l’âge des tissus via plusieurs sentiers à travers de la SASP en plus un appauvrissement de la couche de cellules prolifératives autonome. Divers facteurs pro-inflammatoires, telles que l’IL-6, IL-8, TGFβ et métalloprotéinases matricielles (MMP), sécrétée par les cellules sénescentes, causer des dysfonctions liées à l’âge des tissus par le biais de l’altération de l’homéostasie tissulaire, destruction de l’architecture tissulaire, sénescence des cellules voisines et inflammation stérile18,19. Cependant, SASP peut avoir des effets bénéfiques selon le contexte biologique. En outre, la nature hétérogénétique de SASP dépend du type de cellules sénescentes et le stade de cellules, mettant l’accent sur la nécessité de plus amples recherches19.
Nous décrivons ici les techniques axée sur la cytométrie en flux rapides et sensibles pour évaluer les niveaux intracellulaires de ROS au cours de l’OIS. En outre, les méthodes pour l’analyse des facteurs SASP utilisation quantitative PCR en temps réel (qPCR) et ELISA sont introduites.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous présentons des méthodes de surveillance des niveaux intracellulaires de ROS au cours de la sénescence induite par H-Ras dans les fibroblastes humains normaux WI-38. Intracellulaire ROS dans les cellules vivantes peut être mesurée quantitativement à l’aide du réactif perméable à la cellule DCF-DA et cytométrie en flux. Après absorption cellulaire, DCF-DA est désacétylée par les estérases intracellulaires et, par la suite, oxydé par ROS pour former très fluorescent 2′, 7′-dichlorofluorescéine …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation de la recherche National de Corée (2015R1D1A1A01060839) (à Young Yeon Kim) et par une subvention de la Fondation de recherche National de Corée (NRF) financé par le gouvernement de la Corée (MSIT) (no 2016R1A2B2008887, no 2016R1A5A2007009) (à Jeanho Yun).
Materials
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| BOSC 23 | ATCC | CRL-11269 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| pBabe puro-H-RasV12 | Addgene | 1768 | |
| pGAG/pol | Addgene | 14887 | |
| pVSVG | Addgene | 1733 | |
| Turbofect | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| DCF-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | 10 mM |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| MMLV Reverse transcriptase | Promega | M1701 | |
| SYBR Green PCR master 2X mix | Takara | PR820A | |
| Random Primer | Promega | C118A | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Human IL-6 ELISA assay | PeproTech | #900-TM16 | |
| Human IL-8 ELISA assay | PeproTech | #900_TM18 | |
| EQUIPMENTS | |||
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| Parafilm | BEMIS | PM-996 | |
| Microscope | NIKON | TS100 | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | LSR Fortessa | |
| Amicon Ultra-4ml | Merk Millipore | UFC800324 | |
| NanoDrop spectrophotometer | BioDrop | 80-3006-61 | |
| Real-time PCR System | Applied Biosystems | ABI Prism 7500 | |
| ELISA Reader | Molecular Devices | EMax microplate reader |
References
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