Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

Hücre biyolojik süreçlerin tam bir anlayış moleküler mekanizmaları altında yatan protein etkileşim ağları bulmaya dayanır. Protein etkileşimleri tanımlamak için bir yaklaşım iki protein etki alanı ilgi bir başkasına¹bind sonra işleyen chimeric transkripsiyon faktörü birleştirerek çalışır Maya 2-hibrid (Y2H) tahlil olduğunu. Tipik bir Y2H ekran etkileşen proteinler transkripsiyon harekete geçirmek için erimiş kodlama plazmidler her iki bir kütüphane evler Maya nın nüfusu oluşturularak gerçekleştirilir (Örn., ‘füzyon protein av’) ve protein oluşan bir verilen ‘yem’ plazmid bir DNA bağlayıcı etki alanına (Örneğin, Gal4 ters yönde aktive dizisine bağlar Gal4 DNA’ya bağlanıcı etki alanı) ilgi erimiş. Y2H yaklaşım ana avantajlarından biri nispeten kolay ve ucuz tipik bir laboratuarda yapmak rutin moleküler biyolojik iş²için donatılmış olmasıdır. Ancak, geleneksel olarak gerçekleştirildiğinde, bir kullanıcı seçimi olumlu Y2H etkileşimi için üzerine ortaya çıkan bireysel kolonileri örnekler. Bu ciddi bir şekilde anket Kütüphane ‘av’ klonlar sayısını sınırlar. Belirli bir etkileşen av bolluğu diğerleri düşük bereket av plazmid müdahalesini algılama şansı azalan göre çok yüksek olduğunda bu sorunu bileşik olduğunu.

Proteom kapsamlı kapsama Y2H ilkesini kullanarak için bir çözüm neyin bilinen tek tek av plazmid içeren bir dizi dijital olarak sorguya bir matris biçimli yaklaşım kullanımıdır. Ancak, böyle bir yaklaşım proteinler veya etki alanları³az sayıda interactome tanımlamada ilgilenen bireysel araştırmacılar için kolayca erişilebilir veya maliyet-etkin değil bir altyapı gerektirir. Ayrıca, birden çok parçaya etkileşen proteinlerin kodlamak çok karmaşık av kitaplıkları için pratik boyutları böyle matris dizileri boyutunu artıracağı. Deneyleri karmaşık kütüphaneler ile toplu olarak gerçekleştirmek ve etkileşen klon massive paralel yüksek üretilen iş sıralama⁴kullanan olup olmadığını değerlendirmek için bir alternatiftir. Bu tipik bir kullanarak birden çok koloniler halinde ortaya av plazmidlerin varlığı tahlil uygulanabilir Y2H biçimlendirilmiş hangi Maya hücreleri füzyon protein etkileşen bir çifti konut üzerinde plaka^5,6büyümeye izin yaklaşım. Bu genel bir fikir sorgu her iki birden fazla yem artırmak ve bileşenleri aynı saat^7,8av vurgulu.

Yine de, birçok araştırmalar daha kolay bir henüz daha fazla çaba sadece birkaç protein ‘yemler üzerinde’ odaklı gerektirir ve daha ayrıntılı ve yarı kantitatif sorgusu, bir tek karmaşık av kütüphane tarafından yararlanabilir. Biz geliştirdik ve geniş ölçekli protein etkileşim çalışmaları toplu biçimi⁴‘ te bir Y2H ilkesini kullanarak gerçekleştirmek için bir yaklaşım doğrulanmış. Bu belirli av plazmid genişleme hızı Y2H etkileşim⁹göreli gücü için bir proxy sunucu olarak kullanır. Bir nüfus içinde tüm plazmid derin sıralama için normal büyüme tabi veya seçici büyüme koşulları üreten güçlü ve zayıf Y2H etkileşimleri verim klonların tam bir harita. İnteractors repertuar elde edilen ve doğrudan birden fazla yem plazmid karşılaştırılır. DEEPN (Protein ağları değerlendirme için dinamik zenginleştirme) olarak adlandırdığı elde edilen iş akışı böylece fark interactomes proteinler, vs. başka bir protein arasında karşılaştırma izin tanımlamak için aynı av kitaplıklarındaki tanımlamak için kullanılabilir.

Burada, biz DEEPN göstermek ve hangi Şekil 1‘ de özetlenen onun kullanımını kolaylaştırmak laboratuvar yöntemleri gelişmeler tanıtmak. Önemli iyileştirmeler şunlardır:

Av Maya nüfus nesil. Bir DEEPN anahtar gereksinimleri Maya plazmid av kütüphanelerin aynı dağıtım var farklı yem Plasmid’ler ile nüfus oluşturuyor. Av plazmid Kütüphane eşdeğer taban çizgisi nüfus farklı yemler interactomes arasında doğru karşılaştırmaları yapmak için gereklidir. Bu en iyi zaman bir kütüphane plazmid zaten haploit Maya nüfus içinde yer alan ve verilen yem plazmid nüfus hareketli bir diploid üretmek için çiftleşme tarafından elde elde edilir. Burada, nasıl böyle nüfus haploit Maya yer alan ticari kitaplıklarını kullanma yapmak bir net rehber sağlamak. Her ne kadar diploitler yüksek bir sayı üretmek yöntemleri bulduk, bu ticari kitaplığı içeren maya suşları genel çiftleşme verimliliğini düşüktü. Bu nedenle, biz tepki çiftleşme başına çok daha fazla diploitler verimleri av kitaplıkları ev yeni bir yük inşa.

Yeni yem plazmidler ayarla. Oluşan ‘yem’ füzyon protein faiz ve DNA’ya bağlanıcı etki alanı protein Hızlı birçok geçerli plazmid 2µ onları onların kopya sayısını yükseltmek için izin, tabanlıdır. Bu kopya sayısı oldukça değişken nüfus ve değişkenlik Y2H transkripsiyon yanıt yol. Bu sırayla yetenek seçimi altında hücre büyüme yanıtı dayalı bir verilen protein etkileşimin gücünü ölçmek için çarpık. Bu kısmen bazıları daha önce piyasada bulunan pDEST32¹⁰gibi tarif var bir düşük kopya plazmid kullanarak adres olabilir. Biz Gal4 DNA’ya bağlanıcı etki alanı füzyon proteinler de yem parçaları her iki akıntıya karşı klonlama sağlar Kanr direnç geni taşıyan bir TRP1 düşük kopya şeması tabanlı plazmid içinde üreten yeni bir yem plazmid (pTEF-GBD) inşa ve Gal4 DNA’ya bağlanıcı etki alanının aşağı akım.

Yeni yüksek yoğunluklu Y2H parçasını kitaplık. Biz ev Y2H av kitaplıklara yeni bir plazmid inşa ve rastgele yamultulmuş genomik DNA parçaları Saccharomyces cerevisiaeyapılan son derece karmaşık bir Y2H kütüphane oluşturmak için kullanılır. Dizi analizi bu kitaplığın 1 milyondan fazla farklı elemanları, yukarıda açıklanan Maya genomik Y2H plazmid kitaplıkları¹¹çok daha karmaşık olduğunu göstermiştir. Bu yeni kütüphane ile DEEPN iş akışı karmaşık kütüphaneleri güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde pek çok farklı Plasmid’ler ile karşılamak için güçlü olduğunu göstermek başardık.