Summary

Een test van de Neurosphere voor de evaluatie van de activering van de endogene neurale stamcellen in een muismodel van minimale dwarslaesie

Published: September 13, 2018
doi:

Summary

Hier tonen we de prestaties van een minimale ruggenmerg letsel model in een volwassen muis die de centrale kanaal niche huisvesting endogene neurale stamcellen (NSCs spaart). Laten we zien hoe de bepaling van de neurosphere kan worden gebruikt voor het kwantificeren van activering en migratie van definitieve en primitieve NSCs na verwonding.

Abstract

Neurale stamcellen (NSCs) in het volwassen zoogdieren ruggenmerg zijn een relatief mitotically zwakke bevolking van periventricular cellen die kunnen worden bestudeerd in vitro met behulp van de bepaling van de neurosphere. Deze kolonie-vormende assay is een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van de reactie van NSCs op exogene factoren in een schotel; Dit kan echter ook worden gebruikt om te bestuderen van het effect van in vivo manipulaties met het juiste begrip van de sterke punten en beperkingen van de test. Een manipulatie van het klinische belang is het effect van letsel op de endogene activering van de NSC. Huidige modellen van dwarslaesie bieden een uitdaging om te studeren dit omdat de ernst van de gebruikelijke kneuzingen, compressie en transect modellen leiden tot de vernietiging van de NSC niche op de site van de schade waar de cellen van de stam woont. Hier beschrijven we een minimale schade-model dat gelokaliseerde schade aan het oppervlakkige dorsolateral oppervlak van de thoracale benedenverdieping (T7/8) van het ruggenmerg volwassen muis veroorzaakt. Dit letsel model spaart het centrale kanaal op het niveau van het letsel en vergunningen van de analyse van de NSCs die zich bevinden op het niveau van de laesie op verschillende tijdstippen na letsel. Hier, laten we zien hoe de bepaling van de neurosphere kan worden gebruikt om de activering van de twee afzonderlijke, lineally-gerelateerde, populaties van NSCs die zich in het ruggenmerg periventricular regio – primitieve en definitieve NSCs bevinden studie (pNSCs en dNSCs, respectievelijk). We laten zien hoe u kunt isoleren en cultuur van deze NSCs uit de regio van de periventricular op het niveau van het letsel en de witte stof letsel site. Onze ruggenmerg na chirurgische ontledingen Toon verhoogde aantallen van pNSC en neurospheres dNSC-afgeleid uit de periventricular regio van gewonde koorden in vergelijking met de besturingselementen, hun activering via letsel te spreken. Bovendien, naar aanleiding van schade, dNSC afkomstige neurospheres kunnen worden geïsoleerd van de site schade — aantonen van het vermogen van NSCs om te migreren van hun periventricular-niche naar plaatsen van verwonding.

Introduction

Het centrale zenuwstelsel bevat een subpopulatie van zichzelf vernieuwend, multipotente stamcellen die de capaciteit hebben om te leiden naar alle andere volwassen neurale cel typen1,2,3,4. Deze neurale stamcellen (NSCs) bevinden zich in gespecialiseerde niches in de hersenen en het ruggenmerg en kan worden geactiveerd na letsel te vermenigvuldigen, migreren en differentiëren in volwassen neurale cellen. NSCs en hun nageslacht is gebleken om te migreren naar de site van de schade in5,6van de modellen van de corticale schade. In de hersenen, NSCs gebleken voor het migreren van de laterale ventrikels op de site van schade waar ze onderscheiden in astrocyten die aan gliale litteken vorming7 bijdragen. In het ruggenmerg, echter zijn weinig studies gedaan om te vragen als deze dezelfde endogene NSCs kunnen worden aangewend ter bevordering van herstel na dwarslaesie. Inderdaad, er is momenteel een debat over de vraag of de activering van de pool van de cel van de stam in het ruggenmerg een directe fysieke schade van de niche van de periventricular voering van het centrale kanaal8 vereist of als de schade aan de spinal cord parenchym (verlaten van de stam cel niche intact) is voldoende om te activeren van endogene NSCs9.

Een aantal ruggenmerg letsel (SCI) modellen zijn gebruikt om te studeren de pathofysiologie van acute en chronische blessure. Deze modellen zijn ook gebruikt om te testen potentiële therapieën voor de behandeling van SCI via neuroprotectie, Immunomodulatie en ontwikkelende cel transplantatie/vervanging strategieën10,11,13. Huidige modellen bevatten compressie en/of kneuzingen verwondingen, die leiden grootschalige functionele tekorten evenals uitgebreide laesies en cavitations in het snoer14,15 tot. Resulterende gliale littekens kunnen verschillende spinale segmenten samen met de meerderheid van de breedte/omtrek van het ruggenmerg16beslaan. Dus, terwijl deze modellen klinisch relevante zijn, zij zich veroorloven grote uitdagingen aan het bestuderen van de reactie van endogene NSCs na verwonding. Er zijn chemische modellen van schade die kan worden aangepast als u de mildere vormen van schade die het centrale kanaal17kunt sparen. Echter dit soort schade zich richten op de demyelinisatie SCI is gekoppeld en niet klinisch relevante modellen voor de fysieke en/of mechanische schade in verband met traumatische SCI.

Om de beperkingen van de huidige modellen van de schade, hebben we een naald nummer minimale SCI model, oorspronkelijk ontwikkeld in de rat9, voor de toepassing in een volwassen muismodel aangepast. Ons model aangepast letsel kunt maken van een consistente laesie van de dorsolateral regio van het ruggenmerg muis en sparen van het centrale kanaal op het niveau van het letsel (s). Het voordeel van dit model is dat het mogelijk de studie van NSC kinetiek maakt na letsel en hun potentiële radiale migratie op de site van letsel. Het gebruik van een muismodel staat ook het gebruik van transgene muizen waarmee lineage opvolging van endogene NSCs en hun nakomelingen na letsel. De eigenschappen van NSCs kunnen verder worden beoordeeld met behulp van een aangepaste vorm van de in vitro neurosphere bepaling die in dit protocol is opgenomen.

De bepaling van de neurosphere is een in vitro kolonievormend test waarmee de isolatie van de NSCs in aanwezigheid van mitogenen. Bij klonen plating dichtheden vermenigvuldigen individuele NSCs om te leiden tot vrij zwevende sferische kolonies van cellen die bestaan uit een kleine populaties van NSCs en een overgrote meerderheid van de progenitoren18,19. In ons protocol, we laten zien van het isolement van twee verschillende, lineally-gerelateerde NSCs uit de streek van de periventricular van het ruggenmerg — onder basislijn voorwaarden en na onze minimale SCI-model. Definitieve neurale stengelgroenten uitdrukkelijke nestin van cellen (dNSCs) en de gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP) en zijn gegroeid in aanwezigheid van de epidermale groeifactor (EGF), fibroblast groeifactor (FGF) en heparine (samen genoemd EFH)20. Deze dNSCs zijn zeldzaam in het ruggenmerg naïef, die aanleiding geven tot zeer weinig neurospheres in vitro. Echter, laten we zien dat dNSCs worden geactiveerd na minimale SCI, uitbreiding van het aantal neurospheres van de periventricular regio21geïsoleerd. Primitieve neurale stamcellen (pNSCs) zijn voorafgaand aan de dNSCs in de bloedlijn van neurale stamcellen. pNSCs zijn uiterst zeldzaam, express lage niveaus van de pluripotent markering Oct4, en leukemie remmende factor (LiF) responsieve22. pNSCs vormen geen neurospheres wanneer geïsoleerd van het ruggenmerg volwassen muis als gevolg van de aanwezigheid van myeline basic protein (MBP) in primaire culturen; echter pNSC neurospheres kunnen worden geïsoleerd van MBP deficiënte muizen en hun nummers zijn uitgebreide volgende schade — vergelijkbaar met dNSCs21. Tot slot laten we zien dat dNSC afkomstige neurospheres kunnen worden geïsoleerd van de site van letsel bij vroege tijden na minimale SCI. Deze bevindingen tonen aan dat onze schade model en testen de kenmerken van de activering van periventricular NSCs zoals hun vermogen om te vermenigvuldigen en migreren in reactie op schade kunnen beoordelen.

Protocol

Dit protocol is goedgekeurd door de Commissie van de zorg van het dier aan de Universiteit van Toronto en is in overeenstemming met de “gids voor de zorg en gebruik van proefdieren” (2nd Edition, Canadese Raad op Animal Care, 2017). 1. minimale Spinal Cord Injury chirurgie Opmerking: Vóór de operatie, zorg ervoor dat alle chirurgische instrumenten en materialen zijn gesteriliseerd door passende methoden (figuur 1A). <…

Representative Results

Na de chirurgie, moeten de muizen ervaring minimale motor tekorten, die kunnen bestaan uit staart en mogelijk hind-limb parese gedurende maximaal 24 uur. Na deze tijd, moeten de muizen ervaring geen hind-limb verlamming en/of parese en minimale veranderingen in gang. Figuur 3 toont representatieve resultaten van de neurosphere-bepaling 5 dagen na de minimale dwarslaesie. De absolute aantallen dNSC a…

Discussion

Tijdens de chirurgische ingreep zijn er een paar kritische stappen waar de onderzoeker moet bijzondere aandacht besteden aan het verkrijgen van optimale resultaten en minimaliseren van de variabiliteit tussen de dieren. Wees voorzichtig met het geïnhaleerde anesthesie (Isofluraan) tijdens de operatie als de verdoving is aangetoond te hebben op neuroprotectieve effecten met langdurige blootstelling27. Dienovereenkomstig, bij de studie van het regeneratieve vermogen van het ruggenmerg na letsel, in…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk wordt gefinancierd door de Stichting Krembil (exploitatiesubsidie CMM). WX was de ontvanger van het Carlton Marguerite Smith student award. NL ontving een Graduate beurs van Ontario.

Materials

Agricola Retractor Fine Science Tools 17005-04
Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) Fine Science Tools 15370-50 Customize when ordering to get blunted tips
Graefe Forceps (Straight, 1×2 Teeth) Fine Science Tools 11053-10
Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) Fine Science Tools 11152-10 Or any other forceps for suturing
Hartman Hemostats (Straight) Fine Science Tools 13002-10 Or any other appropriate for suturing
Scalpel Handle #3 Fine Science Tools 10003-12 Or any other appropriate
Hair clippers amazon.ca https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA or any other appropriate
Stereotaxic instrument Stoeling 51500 or any other appropriate
Buprenorphine or any appropirate sanctioned my animal care facility
Meloxicam or any appropriate sanctioned by animal care facility
Tears Naturale P.M. Alcon https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE or any other appropriate
Isoflurane Baxter International Inc DIN 02225875 or any other appropriate for anesthesia
Q-tips Cottom Swabs amazon.ca https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS
Cotton Gauze Fisher Scientific 13-761-52
30G Needles Becton Dickinson 305106 For Injury
25G Needles Becton Dickinson 305122 For Drug injections
1mL Syringes Becton Dickinson 3090659 for drug injections
3mL Syringes Becton Dickinson 309657 for fluid injections
4-0 Suture uoftmedstore.com 2297-VS881 for skin suturing
6-0 Suture uoftmedstore.com VS889 for muscle suturing
Polysporin ointment amazon.ca 102051
Isoflurane Vaporizer VetEquip 901806
15mL conical tubes ThermoFisher Any appropriate
Petri Dishes ThermoFisher any appropriate
Trypan Blue ThermoFisher Any
Hemocytometer ThermoFisher Any appropriate
Centrifuge ThermoFisher Any appropriate
Standard Dissection Tools Fine Science Tools
Dissection Microscope Zeiss Stemi 2000
Counting Microscope Olympus CKX41
Neural Basal-A Medium Invitrogen 10888-022
B27 Invitrogen 17404-044
Penicillin- Streptomycin Gibco 15070
L- Glutamine Gibco 25030
DMEM Invitrogen 12100046
F12 Invitrogen 12700075
30% Glucose Sigma G6152 1M- 9.01g in 100mL dH2O
1M Glucose
7.5% NaHCO3 Sigma S5761 155mM- 1.30g in 100mL dH2O
155mM NaHCO3
1M HEPES Sigma H3375 23.83 g in 100mL dH2O
Apo-Transferrin R&D Systems 3188-AT
Putrescine  Sigma P7505
Insulin Sigma I5500
Selenium Sigma S9133
Progesterone Sigma P6149
Papain Dissociation System  Worthington Biochemical Corporation PDS 1 vial of papain can be used for 2 samples
Epidermal Growth Factor Invitrogen PMG8041 Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer
Fibroblast Growth Factor Invitrogen PHG0226 Powder reconstituted with 0.5mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer
Heparin Sigma H3149
Leukemia Inhibitory Factor In House
Trypan Blue
Hemocytometer
24 well Plates NUNC
2M NaCl Sigma S5886 11.69g in 100mL dH2O
1M KCL Sigma P5405 7.46g in 100mL dH2O
1M MgCl2 Sigma M2393 20.33g in 100mL dH2O
108mM CaCl2 Sigma  C7902 1.59g in 100mL dH2O

References

  1. Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
  2. McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
  3. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
  4. Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
  5. Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
  6. Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
  7. Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
  8. Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports – UK. 7, (2017).
  9. Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. 신경과학. 131 (1), 177-187 (2005).
  10. Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
  11. Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
  12. Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
  13. Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
  14. Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
  15. Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
  16. Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
  17. Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
  18. Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
  19. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
  20. Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
  21. Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
  22. Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
  23. Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
  24. Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
  25. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
  26. Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
  27. Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
  28. Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).

Play Video

Cite This Article
Lakshman, N., Xu, W., Morshead, C. M. A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (139), e57727, doi:10.3791/57727 (2018).

View Video