注射脂多糖对小鼠肠道屏障破坏后微生物源产物的模拟进入
Summary
本文提出了一种模拟肠道屏障破坏后细菌衍生化合物入口的协议。将低致死剂量的脂多糖系统地注入小鼠体内, 对24小时注射后进行监测。在脾、肝、结肠几个时间点上测定了促炎性细胞因子的表达。
Abstract
肠道上皮屏障将宿主与通常耐受或忽略的微生物群分离开来。这种屏障的破坏导致细菌或细菌来源的产品进入宿主, 进入宿主循环和内脏, 导致炎症性肠病 (IBD) 患者观察到无控制发炎, 即的特点是肠道上皮通透性增加。
为了模拟细菌源性化合物进入宿主体内的入口, 采用了内毒素血症模型, 并将脂多糖 (LPS) 作为革兰氏阴性菌外细胞壁的一部分注入小鼠。在本研究中, 致死剂量的 LPS 被腹腔注射, 并随后监测的小鼠8小时使用疾病评分。此外, 在不同时间点的 LPS 注射后, 在脾、肝、结肠中分别分析了炎症细胞因子Il6、 Il1b、和Tnfa的表达水平。该模型可用于研究在侵入微生物或细菌衍生产品后对机体表面的屏障破坏引起的免疫应答。
Introduction
人类肠道被殖民化, 形成了微生物群, 在进化过程中与宿主建立了互惠互利的关系。在这种关系中, 宿主为微生物群提供了一个安全的利基, 而微生物群则提供维生素, 养分消化和保护病原体到宿主, 其中微生物群驻留在1。当宿主和微生物群之间的这种有益关系受到干扰时, 疾病就会发生, 如炎症性肠病 (IBD)。IBD 是由遗传和环境因素引起的肠道慢性炎症性疾病, 发生于两种主要形式, 克罗恩病 (CD) 和溃疡性结肠炎 (UC)。尽管两种 IBD 形式有相似之处, 但它们的特点是炎症修饰的位置和性质存在一定的差异。CD 是一种复发性壁炎症紊乱, 可能扩展到胃肠道的任何部分, 而 UC 是非壁的, 并限于结肠。此外, 核苷酸结合齐聚域含蛋白 2 (NOD2) 的突变, 一种模式识别受体 (PRR), 识别 muramyl 二肽 (MDP), 一个组成部分的细胞壁的大多数革兰氏阳性和阴性细菌, 是与 CD2关联。此外, 大肠杆菌(大肠杆菌)、李斯特菌和链球菌及其产品都在 CD 患者的巨噬细胞中发现, 在屏障破裂3后进入宿主。当细菌或其产品在 CD 的研制过程中进入宿主时, 免疫系统就会产生一种反应, 从而导致生产循环抗菌抗体4。也许, 最有说服力的证据表明, 微生物在 IBD 发病机制中的作用源于老鼠模型。当动物被抗生素治疗, 或当老鼠被保存在无菌 (GF) 条件下, 疾病的严重性在大多数结肠炎模型中减少, 如在 GF 设施中不开发结肠炎的 IL-10-/小鼠5,6。此外, 结肠炎也扰乱了微生物群的组成, 其特点是不平衡的组成和减少的丰富称为 dysbiosis7。IBD 的结果可能是增加肠道通透性, 从而导致微生物和微生物源产品进入宿主。
在动物中, 葡聚糖硫酸钠 (DSS) 的应用诱导肠道上皮破裂, 导致上皮屏障的通透性增强8。门内毒素的浓度在动物中升高, 与 DSS 结肠炎9。有趣的是, 缺乏 C 型凝集素受体特异细胞内黏附分子 molecule-3 抓取 nonintegrin 同源相关 1 (SIGN-R1) 的动物保护不受 DSS 结肠炎和 LPS 诱导的内毒素血症10。为了进一步传播到宿主, 细菌或细菌衍生产品必须通过血管屏障11, 腹膜腔, 在其中的小和大肠, 肠系膜淋巴结和/或肝脏12。为了降低系统的复杂性, 采用了一种定义的细菌衍生化合物。lps, 导致内毒素血症后腹腔 (ip) 或静脉注射 (静脉注射) 注射13注射到小鼠, 研究 interleukins Il6和Ilb和细胞因子Tnfa响应 LPS 的表达。
lps 是一种病原体相关分子模式 (玉兰), 表达为革兰阴性菌的细胞壁成分, 由脂 a (lps 结构中的主要玉兰)、核心寡糖和 O 侧链14组成。由树突状细胞、巨噬素和上皮细胞表达的4类像样受体 (TLR4) 识别 LPS15, 这需要联合受体进行适当的结合。急性期蛋白脂多糖结合蛋白 (LBP) 束缚脂多糖形成一个复杂的转移脂多糖到分化 14 (CD14), 一个 glycosylphosphatidylinositol 定位膜蛋白。CD14 进一步航天飞机 LPS 到淋巴细胞抗原96或也称为 MD-2, 这是与细胞外领域的 TLR4。LPS 与 MD-2 的结合促进了 TLR4/MD-2 的二聚化诱导构象变化, 以吸收细胞内的适配器分子激活下游信号通路14, 其中包括髓系分化初级反应基因 88 (MyD88) 依赖通路和包含适配器诱导干扰素β (TRIF) 依赖通路16。TLR4 对 LPS 的识别然后激活 NF-nf-κb 通路, 诱导炎症细胞因子的表达, 如 TNFα、IL-6 和 IL-1β17。
特别是当 lps 被注射到动物体内时, 应考虑到动物的脂多糖浓度、动物的遗传背景和饮食。高浓度的脂多糖导致感染性休克, 其特点是低血压和多脏器衰竭, 最后到死亡18。与人类相比, 小鼠对 lps 的敏感性较小, 其中脂多糖浓度介于 2-4 ng/千克体重之间 (生物武器) 能够诱发细胞因子风暴19。对于小鼠, 致命剂量 (LD50), 导致死亡的一半的老鼠范围从10-25 毫克/千克体重20取决于使用的鼠标应变。对于常用的小鼠菌株, C57Bl/6 和 BALB/c, 致死剂量 50% (LD50) 为10毫克/千克。相比之下, C3H/HeJ 和 C57BL/10ScCr 的菌株受到 LPS 诱导的内毒素血症的保护, 这是由于Tlr421中的突变造成的。因此, Tlr4-deficient 小鼠 hyporesponsive 注射 LPS22。其他基因修饰的鼠标线, 如 PARP1-/鼠23对 LPS 诱导的毒性休克有抵抗力。
这里描述的老鼠模型使用致死剂量的 lps 进行系统的管理, 以模拟在屏障破坏身体表面后, lps 传播的后果。所选择的 LPS 浓度 (2 毫克/千克) 没有诱发 C56Bl/6 小鼠的死亡率, 而是诱导释放的促炎性细胞因子。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议模仿微生物衍生产品入侵后发生的免疫学过程。该协议中的关键步骤是选择鼠标线、小鼠的卫生状况、脂多糖的剂量、监测动物对内毒素血症的发生情况以及实验终止的时间点。最重要的是, 必须考虑到小鼠菌株的遗传背景。不同的小鼠菌株对 LPS 有不同的敏感性。例如, C3H/HeJ 和 C57BL/10ScCr 小鼠对 LPS 诱导的内毒素血症有抵抗力21,25。此外, 动物的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JHN 得到瑞士国家基金会 (SNSF 310030_146290) 的支持。
Materials
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | K1081 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, | Applied Biosystems, Foster City, CA, USA | 4368813 | |
| RNase-Free DNase Set, | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
| LPS Escherichia coli O111:B4 | Invivogen, San Diego, CA, USA. | tlrl-eblps | |
| Omnican 50 Single-use insulin syringe | B. Braun Melsungen, Melsungen, Germany | 9151125 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologie, Santa Clara, USA | not applicable | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf, Hamburg, Germany | not applicable | |
| Centrifuge Mikro 220R | Hettich, Kirchlengern, Germany | not applicable | |
| Dissection tools | Aesculap, Tuttlingen, Germany | not applicable | |
| Fast-Prep-24 5G Sample Preparation System | M.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USA | not applicable | |
| NanoDrop ND-1000 | NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA | not applicable | |
| TRI Reagent | Zymo Research, Irvine, CA, USA | R2050-1 |
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