Deteção de ativação de Inflammasome e morte celular de Pyroptotic nos macrófagos da medula óssea-derivado murino

Inflamação mediada por Inflammasome é um componente crítico da defesa contra organismos patogénicos¹, mas também está subjacente a etiologia de muitas doenças². A resposta inflamatória a uma ampla gama de infecções é acionada através da detecção citosólica do patógeno associado padrões moleculares (PAMPs) ou danos associados a padrões moleculares (represas). Receptores de reconhecimento padrão (PRR), incluindo membros da família de NOD-like receptor (NLR), oligomerize na detecção destes PAMPs e represas. Isto provoca a formação de um complexo de proteína multi denominado o inflammasome, que contém o PRR, a adaptador da proteína associada a apoptose grão-como contendo um domínio C-terminal de caspase-recrutamento (cartão) (ASC) e a pro-forma de caspase-1^3,4. Este complexo permite induzida por proximidade autoativação de caspase-1. Ativa a caspase-1, em seguida, leva a um conjunto de eventos que são característicos da pyroptosis de caminho de morte celular inflamatória. Estes eventos incluem: a clivagem e liberação das citocinas IL-1 β e IL-18, exocitose lisossomo com lançamento de conteúdo lisossomal no espaço extracelular, condensação nuclear e gasdermin D clivagem. O domínio N-terminal lançado de gasdermin D insere-se na membrana plasmática, formando poros que causam a ruptura da membrana plasmática e liberação do conteúdo inflamatório, além de tirar um nicho protetor para patógeno replicação^{5, 6 , 7}.

Aqui, focalizamos o inflammasome NLRP3 bem estudado. A ativação do inflammasome NLRP3 ocorre através de um processo de duas etapas⁸. O primeiro passo “escorva” ocorre através do reconhecimento por receptores do tipo Toll (TLR) de um produto microbiano. Isto é replicado no cenário de laboratório usando LPS para estimular TLR4. Esta estimulação upregulates NLRP3 e pro-IL-1 β através de sinalização do NF-kB. Escorva adicionalmente licenças NLRP3 através de mecanismos não-transcriptional induzindo sua deubiquitination^9,10 e fosforilação ou desfosforilação de resíduos específicos de^11,12.

O segundo sinal para ativação NLRP3 é pensado para envolver fatores mitocondriais, espécies reativas de oxigênio, efluxo de potássio e cálcio, sinalização, apesar de um mecanismo unificador para ativação NLRP3 permanece elusiva⁸. NLRP3 ativado oligomerizes através de interações entre seus domínios NACHT e recrutas ASC através da ligação dos domínios pyrin (PYD)¹³. Em cada célula, estes complexos macromoleculares formam um único foco microscopicamente visível. ASC foi originalmente identificada como uma proteína KDa 22 que forma uma “mancha” durante a apoptose de células de leucemia humana e chamada apoptose-grão, como proteína associada contendo um cartão¹⁴. Mais tarde foi determinado que o ASC recrutas pro-caspase-1 através da interação do cartão da ASC com o cartão de pro-caspase-1, formando a inflammasome¹⁵.

Nem todos os NLRs exigem a presença de ASC para induzir a ativação de caspase-1. Ao contrário de NLRP3, NLRC4 e NLRP1b têm cartão domínios e diretamente podem recrutar pro-caspase-1 através de interações de cartão-cartão para induzir a ativação de caspase-1. Na ausência de ASC, ativa a caspase-1 permanece difusa por todo o citosol e não forma um único foco. Este ativo difusa caspase-1 é suficiente para induzir a morte celular de pyroptotic, mas é incapaz de processar a pro-IL-1 β^13,16.

Neste manuscrito, discutiremos duas maneiras de avaliar a ativação de inflammasome. O primeiro usa a atividade fluorescente sonda, FAM-YVAD-FMK, que vincula a caspase-1 família de proteases. Esta família inclui caspase-1, mas também do mouse caspase-11 e caspase-4 humano e caspase-5. Usando os macrófagos de camundongos deficientes de caspase-1/11 em todos os experimentos, será abordada a especificidade da sonda. Esse método pode ser combinado com anticorpo rotulagem de inflammasome componentes, que também descreveremos. Visualização microscópica permite a identificação de células individuais contendo ativa a caspase-1 e oligomerized ASC. Usando esse método, os pesquisadores poderão determinar onde na cascata da formação inflammasome suas manipulações da célula hospedeira ou o organismo patogénico em estudo tem um efeito. Por exemplo, pode-se distinguir se uma determinada intervenção impede que o recrutamento de ASC para o NLRP3 complexo ou metas a subsequente recrutamento e ativação de caspase-1¹⁷. Examinar os resultados da ativação de caspase-1 como a secreção de IL-1 β não seria capaz de distinguir entre estas duas possibilidades. Além disso, a secreção de IL-1 β poderia ser alterada sem alterar a capacidade de células para ativar caspase-1 e submeter-se pyroptotic célula morte¹⁶.

O segundo método mede a liberação de lactato desidrogenase (LDH) na célula de sobrenadante, que ocorre durante a lise de macrófagos pyroptotic seguindo a ativação de caspase-1, conforme descrito acima. Este segundo método é uma abordagem baseada na população, como a liberação de LDH em todo o bem é medida. Esta abordagem simples permite a análise rápida (30 minutos de tempo de incubação) das amostras para determinar se há morte celular mediada por caspase-1 e pode ser executada em um formato de placa de 96 poços.

Esses métodos são complementares, cada um com diferentes vantagens e ambos são facilmente passível de modificações. Por exemplo, tratamento de macrófagos com compostos alvo peso molecular pequeno antes da estimulação inflammasome pode ser usado para investigar o papel de certo proteínas podem ter sobre como controlar respostas inflamatórias.