Détection d’Activation Inflammasome et mort cellulaire de Pyroptotic dans les Macrophages dérivés de la moelle osseuse Murine

L’inflammation induite par l’inflammasome est un élément essentiel de la défense contre les organismes pathogènes¹, mais elle sous-tend également l’étiologie des nombreuses maladies². La réponse inflammatoire à un large éventail d’infections est déclenchée par la détection cytosolique de profils moléculaires pathogènes associés (PAMPs) ou dommages associated molecular patterns (DAMPs). Récepteurs de reconnaissance de modèle (PRR), y compris les membres de la famille des récepteurs de type NOD (NLR), oligomerize sur la détection de ces PAMPs et DAMPs. Cela déclenche la formation d’un complexe de plusieurs protéine appelé l’inflammasome, qui contient de la PRR, la protéine adaptatrice associées à l’apoptose speck-protéine contenant un domaine de caspase-recrutement C-terminal (carte) (ASC) et la Pro-forme de Caspase-1^3,4. Ce complexe permet de proximité induite par l’activation automatique de la caspase-1. Caspase-1 active puis conduit à une série d’événements qui sont caractéristiques de la pyroptosis de voie de mort cellulaire inflammatoire. Ces événements incluent : le clivage et la libération des cytokines inflammatoires IL-1β et IL-18, exocytose lysosome avec libération du contenu lysosomial dans l’espace extracellulaire, condensation nucléaire et clivage gasdermin D. Le domaine N-terminal libéré de gasdermin D insère dans la membrane plasmique, formant des pores qui causent la rupture de la membrane plasmique et la libération des matières incendiaires, outre emportant une niche protectrice pour pathogène réplication^{5, 6 , 7}.

Ici, nous nous concentrons sur l’inflammasome NLRP3 bien étudié. L’activation de l’inflammasome NLRP3 s’effectue par un processus de deux étapes⁸. La première étape de « l’amorçage » se produit grâce à la reconnaissance par les récepteurs Toll-like (TLR) d’un produit microbien. C’est répliquée en laboratoire en utilisant des LPS pour stimuler le TLR4. Cette stimulation augmente NLRP3 et pro-IL-1β, par le biais de signalisation NF-kB. D’amorçage en outre licenses NLRP3 grâce à des mécanismes non-transcription en incitant ses déubiquitination^9,10 phosphorylation ou déphosphorylation des résidus spécifiques^11,12.

Le deuxième signal d’activation NLRP3 semble impliquer des facteurs mitochondries, espèces réactives de l’oxygène, efflux de potassium et le calcium de signalisation, un processus unificateur pour activation NLRP3 demeure insaisissable⁸. NLRP3 activés oligomerizes grâce à des interactions entre ses domaines NACHT et recrute ASC via la liaison des domaines pyrine (PYD)¹³. Dans chaque cellule, ces complexes macromoléculaires forment un seul foyer visible au microscope. NCP a été initialement identifiée comme une protéine de 22 KDa qui forme un « grain » au cours de l’apoptose des cellules leucémiques humaines et nommée associées à l’apoptose speck-protéine contenant une carte¹⁴. Il a été déterminé plus tard que l’ASC recrute pro-caspase-1 par le biais de l’interaction de la carte de l’ASC avec la carte de la pro-caspase-1, formant l’ inflammasome¹⁵.

Pas tous NLRs nécessitent la présence d’ASC d’induire l’activation de la caspase-1. Contrairement à NLRP3, NLRC4 et NLRP1b ont des domaines de carte et peuvent recruter directement de pro-caspase-1 via des interactions de carte-carte d’induire l’activation de la caspase-1. En l’absence d’ASC, caspase-1 active reste diffus dans le cytosol et ne forme pas un seul foyer. Cet actif diffuse caspase-1 est suffisante pour induire la mort des cellules pyroptotic, mais ne peut pas traiter les pro-IL-1β^13,16.

Dans ce manuscrit, nous traiterons deux façons d’évaluer inflammasome activation. Le premier utilise l’activité fluorescente probe, FAM-YVAD-FMK, qui lie la famille caspase-1 des protéases. Cette famille comprend caspase-1, mais aussi souris caspase-11 et caspase-4 humain et caspase-5. À l’aide de macrophages de souris déficientes en caspase-1/11 dans toutes les expériences, la spécificité de cette sonde sera abordée. Cette méthode peut être combinée avec l’anticorps étiquetage des composants inflammasome, que nous décrirons également. Visualisation microscopique permet l’identification des cellules individuelles contenant des actifs caspase-1 et CSA oligomerized. En utilisant cette méthode, les chercheurs seront en mesure de déterminer où dans la cascade de formation inflammasome leurs manipulations de la cellule hôte ou de l’organisme pathogène à l’étude ont un effet. Par exemple, on peut distinguer une intervention donnée empêche le recrutement de l’ASC à la NLRP3 complexes ou cible le recrutement et l’activation de la caspase-1¹⁷. Examen des résultats de l’activation de la caspase-1 comme la sécrétion d’IL-1β ne serait pas en mesure de faire la distinction entre ces deux possibilités. En outre, la sécrétion d’IL-1β pourrait être modifiée sans altérer les cellules permet d’activer la caspase-1 et subir de mort cellulaire pyroptotic¹⁶.

La deuxième méthode permet de mesurer la libération de la lactate déshydrogénase (LDH) dans la cellule surnageante, qui se produit lors de la lyse pyroptotic macrophage après l’activation de la caspase-1 tel que décrit ci-dessus. Cette deuxième méthode est une approche axée sur la population, la libération de LDH dans l’ensemble du bien est mesurée. Cette approche simple permet l’analyse rapide (30 min de temps d’incubation) d’échantillons pour déterminer s’il y a la mort cellulaire médiée par caspase-1 et peut être réalisée dans un format de plaque à 96 puits.

Ces méthodes sont complémentaires, chacune avec différents avantages et les deux se prêtent facilement à des modifications. Par exemple, traitement des macrophages avec ciblée de faible poids moléculaire des composés avant inflammasome stimulation permet d’enquêter sur le rôle de certain protéines peuvent avoir sur le contrôle des réactions inflammatoires.