Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출
Summary
형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 및 활성 caspase-1와 어댑터, ASC에 대 한 얼룩 세포질 기준 NLRP3 inflammasome 활성화의 탐지를 설명 합니다. 젖 산 효소 자료 분석 결과 인구 기준 pyroptotic 세포를 감지 하 여. 이 기술은 inflammasome 생물학의 여러 측면을 연구 적응 될 수 있다.
Abstract
Inflammasomes는 많은 병원 성 생물의 성공적인 제어에 필요한 하지만 또한 염증 촉진 하는 타고 난 면역 신호 플랫폼 autoinflammatory 질병. Inflammasomes 끄 덕 같은 수용 체 (NLR) 가족의 일원을 포함 하 여 cytosolic 패턴 인식 수용 체에 의해 활성화 됩니다. 이 수용 체는 미생물 또는 손상 관련 된 자극의 감지 시 oligomerize. 접합 기 단백질 ASC의 후속 모집 caspase-1 근접 유도 자동 활성화를 통해 활성화 현미경으로 보이는 inflammasome 복잡 한, 형성 한다. 활성화, 따라 caspase-1 프로-일리노이-1β 및 프로-일-18, 활성화 및 이러한 프로 염증 성 cytokines의 분 비를 앞. Caspase-1는 또한 염증 성 형태의 세포 죽음 pyroptosis, 기능 막 무결성 및 셀 세포의 손실이 되 나 중재. Caspase-1 gasdermin D, 원형질 막 숨 구멍을 형성 하는 N 맨끝 파편 공개 삼투성 세포로 이어지는 앞.
골 수 유래 세포 caspase-1 활동 프로브 팸-YVAD-FMK의 라벨 및 어댑터 단백질 ASC에 대 한 항 체와 함께 셀 라벨 시험관, caspase-1의 활성화를 확인할 수 있습니다. 이 기술은 inflammasome 형성 및 caspase-1 활성화 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 개별 셀에 식별 수 있습니다. Pyroptotic 세포 죽음은 매체에 cytosolic 젖 산 효소의 릴리스를 측정 하 여 검색할 수 있습니다. 이 절차는 간단 하 고 비용 효과적인 심사에 대 한 적응을 허용 96 잘 접시 형태로 수행 합니다. 이 원고에서 우리 표시 nigericin, NLRP3 inflammasome의 활성화 어댑터 단백질 ASC 및 활성 caspase-1, 공동 현지화를 리드 pyroptosis로 이어지는.
Introduction
Inflammasome 중재 염증 병원 성 유기 체1에 대 한 방어의 중요 한 구성 요소 이지만, 또한 많은 질병2의 병 인 기초. 다양 한 감염에 염증 반응을 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs)의 cytosolic 탐지에 의해 트리거되는 또는 손상 관련 된 분자 패턴 (DAMPs). 패턴 인식 수용 체 (PRR), 끄 덕 임 같이 수용 체 (NLR) 가족의 일원을 포함 하 여 이러한 감지 시 oligomerize PAMPs 및 DAMPs. 이 다중 단백질 복잡 한 inflammasome, PRR, Apoptosis 관련 스펙 같은 단백질 C 터미널 caspase 신규 모집 도메인 (카드) (ASC), 그리고 프로 형태의 포함 된 어댑터 단백질을 포함 하 되 나의 형성을 유발 caspase-13,4. 이 복잡 한 근접 유도 caspase-1의 자동 활성화 수 있습니다. 활성 caspase-1 다음 이벤트 염증 성 세포 죽음 통로 pyroptosis의 특성 집합을 리드. 이 이벤트에 포함 됩니다: 분열 그리고 염증 성 cytokines 일리노이-1β 및 세포 외 공간, 핵 응축 및 gasdermin D 분열에 lysosomal 내용의 출시와 함께 리소좀 exocytosis IL 18의 릴리스. Gasdermin D의 출시 된 N 맨끝 도메인 원형질 막 파열 및 병원 체 복제5, 에 대 한 보호 틈새를 데 려 하는 것 외에도 염증 성 내용의 자료를 일으키는 원인이 되는 숨 구멍을 형성 하는 원형질 막에 삽입 6 , 7.
여기, 우리는 잘 공부 NLRP3 inflammasome에 집중 한다. NLRP3 inflammasome의 활성화 2 단계 과정8통해 발생합니다. “프라이 밍”의 첫 번째 단계는 미생물 제품의 통행세 같이 수용 체 (TLR)에 의해 인식 통해 발생합니다. 이 LPS TLR4 자극을 사용 하 여 실험실에서 복제 됩니다. 이 자극 upregulates NLRP3 및 프로-일리노이-1β NF kB 신호를 통해 합니다. 또한 못쓰게 비 transcriptional 메커니즘을 통해 유도 deubiquitination9,10 및 인 산화 또는 특정 잔류물11,12dephosphorylation NLRP3 라이센스.
NLRP3 정품 인증에 대 한 두 번째 신호는 미토 콘 드 리아 요인, 반응성 산소 종, 칼륨 경과 및 신호, 칼슘을 포함 하는 NLRP3 활성화를 위한 통합 메커니즘 애매8남아 있지만 생각 된다. 활성화 된 NLRP3의 시 1 도메인 간의 상호 작용을 통해 oligomerizes 그리고 pyrin (PYD) 도메인13의 바인딩을 통해 ASC 신병. 각 셀에 이러한 고분자 단지 단일 현미경으로 보이는 초점을 형성 한다. ASC 22 KDa 단백질 인간의 백혈병 세포의 apoptosis 동안 “반점”를 형성 하 고 명명 된 apoptosis 관련 스펙 같은 단백질 포함 된 카드14원래 확인 되었다. 그것은 나중에 ASC 프로-caspase-1 inflammasome15형성 프로-caspase-1의 카드와 함께 ASC의 카드의 상호 작용을 통해 신병 결정 되었다.
모든 NLRs는 caspase-1 활성화를 유도 하는 ASC의 존재를 필요로. 달리 NLRP3, NLRC4 및 NLRP1b 카드 도메인 있고 프로-caspase-1 카드-카드 상호 작용 caspase-1 활성화 유도를 통해 모집 직접 수 있습니다. ASC의 부재, 활성 caspase-1는 cytosol에 걸쳐 확산 유적과 단일 초점을 형성 하지 않습니다. 확산이 활성 caspase-1 pyroptotic 세포 죽음을 유도 하기에 충분 하지만 프로 일 1β13,16처리할 수 있습니다.
이 원고에서 우리 inflammasome 활성화를 평가 하기 위해 두 가지 방법을 설명 합니다. 첫 번째 사용 하 여 형광 활동 프로브, FAM-YVAD-FMK, 프로 테아 제 caspase-1 제품군을 바인딩합니다. 이 가족 caspase-1, 또한 마우스 caspase-11와 인간의 caspase-4 caspase-5 포함 되어 있습니다. 모든 실험에 caspase-1/11 결핍 쥐에서 세포를 사용 하 여이 프로브의 특이성을 해결 것입니다. 이 방법은 항 체 또한 설명 합니다 inflammasome 부품의 라벨 결합 될 수 있다. 현미경 시각화는 개별 셀을 포함 하는 활성 caspase-1와 oligomerized ASC의 식별에 대 한 수 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여, 연구원은 어디 inflammasome 형성 캐스케이드 호스트 셀 또는 연구에서 병원 성 유기 체 그들의 조작 효과가지고 결정할 수 됩니다. 예를 들어 하나의 주어진된 개입 복잡 한 NLRP3를 ASC의 채용을 방지 또는 후속 모집과 caspase-117의 활성화 여부를 구분할 수 있습니다. Caspase-1 활성화 IL 1β 분 비 등의 결과 검토 것 수 없습니다 이러한 두 가능성 사이 구별 하. 또한, IL 1β의 분 비는 caspase-1을 활성화 하 고 pyroptotic 세포 죽음16받을 수 셀을 변경 하지 않고 변경 될 수 있습니다.
두 번째 방법은 위에서 설명한 caspase-1 활성화 다음 pyroptotic 대 식 세포 세포의 용 해 도중 발생 하는 표면에 뜨는, 셀으로 젖 산 효소 (LDH)의 출시를 측정 합니다. 이 두 번째 방법은 전체에서 LDH의 릴리스 잘 측정은 인구에 기초를 둔 접근 이다.입니다. 이 간단한 접근 caspase 1 중재 하는 세포 죽음 인지 확인 하려면 샘플의 빠른 분석 (보육 시간 30 분)에 대 한 허용 하 고 96 잘 접시 형태로 수행할 수 있습니다.
이러한 메서드는 상호 보완적인, 각각 다른 장점, 그리고 둘 다 쉽게 수정 의무가 있습니다. 예를 들어 inflammasome 자극 이전 대상된 작은 분자량 화합물과 대 식 세포 치료 단백질에 선 동적인 응답을 제어 할 수 있습니다 특정 역할을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고에서 우리 inflammasome 활성화 및 caspase-1 활성화 murine 골 수 유래 세포에서 NLRP3 자극을 다음의 결과 검사 하는 두 가지 방법을 제시 했습니다. 첫 번째 기술은 형광 기자 팸-YVAD-FMK를 사용 하 여 셀룰러 기준 caspase-1 활성화의 수준을 결정 하는 연구원을 수 있습니다. 이 기자는 caspase-1/11 결핍 세포에 얼룩의 부재에 의해 본 바인딩 효소, caspase-1 가족에 대 한 매우 구체적인. 특이성은 또한 LaRock <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
모든 현미경 W. M. 켁 현미경 센터 다니엘 피터 스의 지원 및 NIH 포상 S10OD016240의 지원으로 이루어졌다. S.L.F.는 NIH K08AI119142와 R21AI130281에 의해 지원 됩니다. 우리는 박사 리처드 Flavell 및 caspase-1/11 결핍 마우스, 박사 브래드 쿡 박사 브래드 쿡 실험실 시설 및 장비를 공유 하기 위한 감사 합니다.
Materials
| E-MEM | ATCC | 30-2003 | For growing L929 cells |
| NCRC clone 929 (L929) | ATCC | CCL-1 | |
| Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde |
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay | Fisher Scientific | PR-G1780 | Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid |
| FAM-YVAD-FMK | Immunocytochemistry Technologies | 98 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Invitrogen | 11960044 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium | Invitrogen | 14190144 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin | Invitrogen | 26140079 | Heat inactivated at 55°C for 50 min |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| ProLong Gold Mounting Medium | Invitrogen | p36934 | Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46 |
| goat anti-mouse ALEXA555 | Invitrogen | A-21422 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Invitrogen | 11344041 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| TO-PRO-3 Iodide | Invitrogen | T3605 | far-red fluorescent nucleic acid stain |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratoy | 000664 | |
| caspase-1/11-/- mouse | Jackson Laboratory | 016621 | |
| Leica SP8X Confocal Microscope | Leica | ||
| Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) | List Biologicals | 434 | |
| anti-ASC clone 2EI-7 | Millipore-Sigma | 04-417 | |
| beta-mercapto-ethanol | Millipore-Sigma | M6250-10ML | |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650-5X10ML | |
| EDTA | Millipore-Sigma | E5391 | |
| Spectramax M3 plate reader | Molecular Devices | 5000414 |
References
- Jorgensen, I., Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).
- Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. T. Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat Rev Microbiol. 7 (2), 99-109 (2009).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cell Microbiol. 8 (11), 1812-1825 (2006).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., den Hartigh, A. B., Loomis, W. P., Cookson, B. T. Coordinated host responses during pyroptosis: caspase-1-dependent lysosome exocytosis and inflammatory cytokine maturation. J Immunol. 187 (5), 2748-2754 (2011).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Sutterwala, F. S., Haasken, S., Cassel, S. L. Mechanism of NLRP3 inflammasome activation. Ann N Y Acad Sci. 1319, 82-95 (2014).
- Juliana, C., et al. Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation. J Biol Chem. 287 (43), 36617-36622 (2012).
- Py, B. F., Kim, M. S., Vakifahmetoglu-Norberg, H., Yuan, J. Deubiquitination of NLRP3 by BRCC3 critically regulates inflammasome activity. Mol Cell. 49 (2), 331-338 (2013).
- Song, N., et al. NLRP3 Phosphorylation Is an Essential Priming Event for Inflammasome Activation. Mol Cell. 68 (1), 185-197 (2017).
- Stutz, A., et al. NLRP3 inflammasome assembly is regulated by phosphorylation of the pyrin domain. J Exp Med. 214 (6), 1725-1736 (2017).
- Broz, P., Dixit, V. M. Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling. Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).
- Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).
- Yamamoto, M., et al. ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules. Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).
- Miao, E. A., Rajan, J. V., Aderem, A. Caspase-1-induced pyroptotic cell death. Immunol Rev. 243 (1), 206-214 (2011).
- LaRock, C. N., Cookson, B. T. The Yersinia virulence effector YopM binds caspase-1 to arrest inflammasome assembly and processing. Cell Host Microbe. 12 (6), 799-805 (2012).
- Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect Immun. 63 (9), 3609-3620 (1995).
- Miller, S. I., Ernst, R. K., Bader, M. W. LPS, TLR4 and infectious disease diversity. Nat Rev Microbiol. 3 (1), 36-46 (2005).
- Sester, D. P., et al. A novel flow cytometric method to assess inflammasome formation. J Immunol. 194 (1), 455-462 (2015).
- Sester, D. P., et al. Assessment of Inflammasome Formation by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2016).
- DiPeso, L., Ji, D. X., Vance, R. E., Price, J. V. Cell death and cell lysis are separable events during pyroptosis. Cell Death Discov. , (2017).
- Russo, H. M., et al. Active Caspase-1 Induces Plasma Membrane Pores That Precede Pyroptotic Lysis and Are Blocked by Lanthanides. J Immunol. 197 (4), 1353-1367 (2016).
- Evavold, C. L., et al. The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages. Immunity. , (2017).
