Rilevamento di attivazione Inflammasome e morte delle cellule Pyroptotic in macrofagi murini derivate da midollo osseo
Summary
Descriviamo la rilevazione di NLRP3 inflammasome attivazione su base cellulare utilizzando la microscopia a fluorescenza e la macchiatura per active caspasi-1 e l’adattatore, ASC. Un test di rilascio di lattato deidrogenasi è presentato per rilevare pyroptotic lisi su base di popolazione. Queste tecniche possono essere adattate per studiare molti aspetti della biologia inflammasome.
Abstract
Inflammasomes sono innate piattaforme di segnalazione immuni che sono necessari per il controllo di successo di molti organismi patogeni, ma anche promuovono infiammatori e malattie autoinfiammatorie. Inflammasomes sono attivati da recettori di riconoscimento modello citosolico, compresi i membri della famiglia del recettore (NLR) NOD-come. Questi recettori oligomerizzazione al rilevamento di stimoli microbici o danni associati. Successiva assunzione della proteina adattatore ASC forma un inflammasome microscopicamente visibili complessi, che attiva la caspasi-1 attraverso l’auto-attivazione indotta da vicinanza. Dopo l’attivazione, caspasi-1 fende il pro-IL-1 β e pro-IL-18, che porta alla attivazione e secrezione di queste citochine pro-infiammatorie. Caspasi-1 media anche la forma infiammatoria della morte delle cellule, chiamata pyroptosis, che presenta la perdita di lisi delle cellule e l’integrità della membrana. Caspasi-1 fende gasdermin D, rilasciando il frammento N-terminale che forma i pori della membrana plasmatica, che porta alla lisi osmotica.
In vitro, l’attivazione di caspasi-1 può essere determinato dall’etichettatura derivate da midollo osseo macrofagi con la sonda di attività caspase-1 FAM-YVAD-FMK e identificando le cellule con anticorpi contro la proteina dell’adattatore ASC. Questa tecnica permette l’identificazione di inflammasome formazione e attivazione di caspasi-1 nelle singole celle utilizzando la microscopia a fluorescenza. Pyroptotic la morte delle cellule può essere rilevata misurando il rilascio di lattato deidrogenasi citosolica nel mezzo. Questa procedura è semplice, conveniente ed eseguita in un formato di piastra a 96 pozzetti, consentendo l’adattamento per lo screening. In questo manoscritto, indichiamo che l’attivazione del inflammasome NLRP3 di Nigericina conduce alla co-localizzazione della proteina dell’adattatore ASC e attiva caspase-1, che conduce a pyroptosis.
Introduction
Inflammasome-ha mediato l’infiammazione è una componente critica della difesa contro organismi patogeni1, ma anche sottende l’eziologia di molte malattie2. La risposta infiammatoria ad una vasta gamma di infezioni viene attivata dal rilevamento citosolico di agente patogeno connesso pattern molecolari (PAMPs) o danni associati pattern molecolari (Damp). Recettori di riconoscimento di pattern (PRR), compresi i membri della famiglia del recettore NOD-like (NLR), oligomerizzazione dopo il rilevamento di questi PAMP e DAMPs. Questo innesca la formazione di un complesso multiproteico chiamato il inflammasome, che contiene il PRR, la proteina dell’adattatore apoptosi-collegata speck-come proteina contenente un dominio di caspase-reclutamento del C-terminale (scheda) (ASC) e il pro-forma di caspasi-13,4. Questo complesso permette di prossimità-indotto auto-attivazione di caspasi-1. Attiva la caspasi-1 quindi conduce ad un insieme di eventi che caratterizzano la cellula infiammatoria morte via pyroptosis. Tali eventi includono: la scissione e il rilascio di citochine infiammatorie IL-1 β e IL-18, esocitosi lisosoma con rilascio di lysosomal contenuto nello spazio extracellulare, condensazione nucleare e gasdermin D clivaggio. Il dominio N-terminale rilasciato di gasdermin D inserisce nella membrana plasmatica, formando pori che causano la rottura della membrana del plasma ed il rilascio del contenuto infiammatorio, oltre a togliere una nicchia protettiva per agente patogeno replica5, 6 , 7.
Qui, ci concentriamo sul inflammasome NLRP3 ben studiato. L’attivazione del inflammasome NLRP3 avviene attraverso un processo di due passaggi8. Il primo passo di “adescamento” avviene attraverso il riconoscimento di recettori Toll-like (TLR) di un prodotto microbico. Questo è replicato nell’impostazione del laboratorio usando LPS per stimolare TLR4. Questa stimolazione sopraregola NLRP3 e pro-IL-1 β attraverso segnalazione di NF-kB. Adescamento inoltre licenze NLRP3 attraverso meccanismi non-trascrizionale inducendo la sua deubiquitinazione9,10 e fosforilazione o defosforilazione di specifici residui11,12.
Il secondo segnale per l’attivazione NLRP3 è pensato per coinvolgere fattori mitocondriali, specie reattive dell’ossigeno, efflusso di potassio e calcio segnalazione, anche se un meccanismo unificante per l’attivazione NLRP3 rimane inafferrabile8. NLRP3 attivato oligomerizes attraverso le interazioni tra i suoi domini NACHT e reclute ASC tramite associazione dei domini pirina (PYD)13. In ogni cella, questi complessi macromolecolari formano un singolo fuoco microscopicamente visibile. ASC è stata originariamente identificata come una proteina di KDa 22 che si forma un “granello” durante l’apoptosi di cellule umane di leucemia e denominata apoptosi-collegata speck-come proteina che contiene una carta14. In seguito fu stabilito che ASC reclute pro-caspase-1 attraverso l’interazione della scheda di ASC con la carta del pro-caspase-1, formando il inflammasome15.
Non tutte le NLRs richiedono la presenza di ASC per indurre l’attivazione di caspasi-1. A differenza di NLRP3, NLRC4 e NLRP1b hanno carta domini e può reclutare direttamente pro-caspase-1 tramite interazioni di CARD-CARD per indurre l’attivazione di caspasi-1. In assenza di ASC, attiva la caspasi-1 rimane diffusa in tutto il citosol e non forma un singolo fuoco. Questa diffusa attiva caspasi-1 è sufficiente per indurre la morte delle cellule di pyroptotic, ma è in grado di elaborare pro-IL-1 β13,16.
In questo manoscritto, discuteremo due modi per valutare l’attivazione inflammasome. Il primo utilizza l’attività fluorescente della sonda, FAM-YVAD-FMK, che lega la famiglia delle proteasi caspasi-1. Questa famiglia comprende caspasi-1, ma anche del mouse caspase-11 e umano caspase-4 e caspase-5. Utilizzando i macrofagi dai topi caspase-1/11 in tutti gli esperimenti, si affronterà la specificità di questa sonda. Questo metodo può essere combinato con l’anticorpo etichettatura dei componenti inflammasome, che descriveremo anche. Visualizzazione al microscopio permette l’identificazione delle singole celle contenenti active caspasi-1 e oligomerico ASC. Utilizzando questo metodo, i ricercatori saranno in grado di determinare dove nella cascata di formazione inflammasome loro manipolazioni della cellula ospite o l’organismo patogeno sotto studio hanno un effetto. Ad esempio, si può distinguere se un determinato intervento previene l’assunzione di ASC per la NLRP3 complesse o le destinazioni il successivo reclutamento e attivazione di caspasi-117. Esaminando i risultati dell’attivazione di caspasi-1 come la secrezione di IL-1 β non sarebbe in grado di distinguere tra queste due possibilità. Inoltre, la secrezione di IL-1 β potrebbe essere alterata senza alterare la capacità delle cellule di attivare le caspasi-1 e subire pyroptotic delle cellule morte16.
Il secondo metodo misura il rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) nella cella surnatante, che si verifica durante la lisi del macrofago pyroptotic seguendo l’attivazione di caspasi-1, come descritto in precedenza. Questo secondo metodo è un approccio basato sulla popolazione come bene è misurato il rilascio di LDH in tutto l’edificio. Questo semplice approccio permette l’analisi rapida (30 min di incubazione) di campioni per determinare se c’è morte caspase-1-mediata delle cellule e può essere eseguito in un formato di piastra a 96 pozzetti.
Questi metodi sono complementari, ciascuno con vantaggi diversi ed entrambi sono facilmente suscettibili di modifiche. Ad esempio, trattamento del macrofago con composti di peso molecolare mirata prima inflammasome stimolazione può essere utilizzato per studiare il ruolo di alcune proteine possono avere su come controllare le risposte infiammatorie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo manoscritto, abbiamo presentato due tecniche per esaminare inflammasome attivazione e la conseguenza dell’attivazione di caspase-1 che segue NLRP3 stimolazione in macrofagi murini derivanti dal midollo osseo. La prima tecnica consente al ricercatore di determinare il livello di attivazione di caspasi-1 su una base cellulare utilizzando il reporter fluorescente FAM-YVAD-FMK. Questo giornalista è altamente specifico per l’associazione della famiglia di caspase-1 degli enzimi, come si vede dall’assenza di coloraz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tutta la microscopia è stato fatto presso il centro di microscopia di W. M. Keck con supporto di Nathaniel Peters e con il supporto del premio NIH S10OD016240. S.l.f. è supportato da NIH K08AI119142 e R21AI130281. Si ringraziano il Dr. Richard Flavell e Dr. Brad Cookson per topi caspase-1/11 e Dr. Brad Cookson per la condivisione di attrezzature e strutture di laboratorio.
Materials
| E-MEM | ATCC | 30-2003 | For growing L929 cells |
| NCRC clone 929 (L929) | ATCC | CCL-1 | |
| Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde |
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay | Fisher Scientific | PR-G1780 | Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid |
| FAM-YVAD-FMK | Immunocytochemistry Technologies | 98 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Invitrogen | 11960044 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium | Invitrogen | 14190144 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin | Invitrogen | 26140079 | Heat inactivated at 55°C for 50 min |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| ProLong Gold Mounting Medium | Invitrogen | p36934 | Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46 |
| goat anti-mouse ALEXA555 | Invitrogen | A-21422 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Invitrogen | 11344041 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| TO-PRO-3 Iodide | Invitrogen | T3605 | far-red fluorescent nucleic acid stain |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratoy | 000664 | |
| caspase-1/11-/- mouse | Jackson Laboratory | 016621 | |
| Leica SP8X Confocal Microscope | Leica | ||
| Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) | List Biologicals | 434 | |
| anti-ASC clone 2EI-7 | Millipore-Sigma | 04-417 | |
| beta-mercapto-ethanol | Millipore-Sigma | M6250-10ML | |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650-5X10ML | |
| EDTA | Millipore-Sigma | E5391 | |
| Spectramax M3 plate reader | Molecular Devices | 5000414 |
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