Påvisning af Inflammasome aktivering og Pyroptotic celledød i Murine knoglemarv-afledte makrofager
Summary
Vi beskriver påvisning af NLRP3 inflammasome aktivering på cellulære grundlag ved hjælp af Fluorescens mikroskopi og farvning for aktive caspase-1 og adapteren, ASC. En laktat dehydrogenase release assay er præsenteret for at opdage pyroptotic lysis på grundlag af befolkningen. Disse teknikker kan tilpasses for at studere mange aspekter af inflammasome biologi.
Abstract
Inflammasomes er medfødte immun signaling platforme, der er nødvendige for vellykket kontrol af mange patogene organismer, men også fremme inflammatoriske og autoinflammatory sygdomme. Inflammasomes aktiveres ved cytosole mønster anerkendelse receptorer, herunder medlemmer af familien NOD-lignende receptor (NLR). Disse receptorer oligomerize ved påvisning af mikrobiel eller skade-associerede stimuli. Efterfølgende ansættelse af adapter protein ASC danner en mikroskopisk synlige inflammasome komplekse, som aktiverer caspase-1 gennem nærhed-induceret auto-aktivering. Efter aktivering kløver caspase-1 pro-IL-1β og pro-IL-18, fører til aktivering og udskillelsen af disse pro-inflammatoriske cytokiner. Caspase-1 også medierer inflammatorisk form for celledød kaldes pyroptosis, som byder på tabet af membran integritet og celle lysering. Caspase-1 kløver gasdermin D, frigiver den N-terminale fragment, som er plasma membran porer, hvilket fører til osmotisk lysering.
In vitro, aktivering af caspase-1 kan bestemmes ved mærkning knoglemarv-afledte makrofager med caspase-1 aktivitet sonden FAM-YVAD-FMK og ved mærkning celler med antistoffer mod adapter protein ASC. Denne teknik giver mulighed for identificering af inflammasome dannelse og caspase-1 aktivering i enkelte celler ved hjælp af Fluorescens mikroskopi. Pyroptotic celledød kan påvises ved at måle udgivelsen af cytosole laktat dehydrogenase til mediet. Denne procedure er enkel, omkostningseffektiv og udført i en 96-brønd plade format, muliggør tilpasning til screening. I dette manuskript viser vi, at aktivering af NLRP3 inflammasome af nigericin fører Co lokalisering af adapter protein ASC og aktive caspase-1, fører til pyroptosis.
Introduction
Inflammasome-medieret betændelse er et afgørende element i forsvar mod patogene organismer1, men også ligger til grund for ætiologien af mange sygdomme2. Det inflammatoriske respons til en bred vifte af infektioner er udløst af cytosole påvisning af patogenet associeret molekylære mønstre (PAMPs) eller skader associeret molekylære mønstre (DAMPs). Mønster anerkendelse receptorer (PRR), herunder medlemmer af familien NOD-lignende receptor (NLR) oligomerize ved detektion af disse PAMPs og DAMPs. Dette udløser dannelsen af et multi protein kompleks betegnes inflammasome, som indeholder PRR, adapter protein apoptose-associerede plet-lignende protein som indeholder et C-terminale caspase-rekruttering domæne (kort) (ASC) og Pro form af caspase-13,4. Dette kompleks tillader nærhed-induceret auto-aktivering af caspase-1. Aktive caspase-1 og derefter fører til et sæt af begivenheder, der er karakteristiske for inflammatoriske celle død pathway pyroptosis. Disse arrangementer omfatter: kavalergang og frigivelsen af inflammatoriske cytokiner IL-1β og IL-18, lysosomet exocytose med frigivelse af lysosomale indholdet i det ekstracellulære rum, nukleare kondens og gasdermin D kavalergang. Domænet frigivne N-terminalen af gasdermin D indsættes i plasma membranen, danner porer, der forårsager plasmamembran brud og frigivelsen af inflammatoriske indholdet, ud over at tage væk en beskyttende niche for patogenet replikering5, 6 , 7.
Her fokuserer vi på de velundersøgte NLRP3 inflammasome. Aktivering af NLRP3 inflammasome sker gennem en to-trins proces8. Den første “priming” skridt opstår ved anerkendelse af Toll-lignende receptorer (TLR) af en mikrobiel produkt. Dette er gentaget i indstillingen laboratorium ved hjælp af LP’ER til at stimulere TLR4. Denne stimulation upregulates NLRP3 og pro-IL-1β gennem NF-kB signalering. Priming desuden licenser NLRP3 gennem ikke-transcriptional mekanismer ved at inducere sin deubiquitination9,10 og fosforylering eller dephosphorylation af specifikke restkoncentrationer11,12.
Det andet signal for NLRP3 aktivering menes at inddrage mitokondrie faktorer, reaktive ilt arter, kalium efflux og calcium signalering, selv om en samlende mekanismen for NLRP3 aktivering stadig undvigende8. Aktiveret NLRP3 oligomerizes gennem interaktioner mellem dens NACHT domæner og rekrutter ASC via binding af pyrin (PYD) domæner13. I hver celle danne disse makromolekylære komplekser en enkelt mikroskopisk synlige fokus. ASC blev oprindeligt identificeret som en 22 KDa protein, som danner en “plet” under apoptose af humane leukæmiceller og navngivne apoptose-associerede plet-lignende protein som indeholder en kort14. Senere blev det fastslået, at ASC rekrutter pro-caspase-1 gennem samspillet mellem ASC kort med kort af pro-caspase-1, danner inflammasome15.
Ikke alle NLRs kræver tilstedeværelse af ASC til at fremkalde caspase-1 aktivering. I modsætning til NLRP3, NLRC4 og NLRP1b har kort domæner og kan direkte ansætte pro-caspase-1 via kort-kort interaktioner at fremkalde caspase-1 aktivering. I mangel af ASC, aktive caspase-1 er stadig diffus i hele cytosol og udgør ikke en enkelt fokus. Denne diffuse aktive caspase-1 er tilstrækkelig til at fremkalde pyroptotic celledød, men er ikke i stand til at behandle pro-IL-1β13,16.
I dette manuskript, vil vi diskutere to måder at vurdere inflammasome aktivering. Først bruger de fluorescerende aktivitet sonde, FAM-YVAD-FMK, som binder caspase-1 familie af proteaser. Denne familie indeholder caspase-1, men også mus caspase-11 og menneskelige caspase-4 og caspase-5. Ved hjælp af makrofager fra caspase-1/11 mangelfuld mus i alle forsøg, vil blive behandlet af denne sonde specificitet. Denne metode kan kombineres med antistof mærkning af inflammasome komponenter, som vi også vil beskrive. Mikroskopiske visualisering giver mulighed for identifikation af individuelle celler, der indeholder aktive caspase-1 og oligomerized ASC. Du bruger denne metode, vil forskere kunne bestemme hvor i inflammasome dannelse cascade deres manipulationer af cellen vært eller den sygdomsfremkaldende organisme under studiet har en effekt. For eksempel kan man skelne om en given intervention forhindrer ansættelse af ASC til NLRP3 komplekse eller mål efterfølgende rekruttering og aktivering af caspase-117. Undersøge resultaterne af caspase-1 aktivering som IL-1β sekretion ville ikke være i stand til at skelne mellem disse to muligheder. Ligeledes kunne sekretion af IL-1β ændres uden at ændre cellerne evnen til at aktivere caspase-1 og gennemgå pyroptotic celle død16.
Den anden metode måler frigivelse af laktat dehydrogenase (LDH) i cellen supernatanten, som opstår under pyroptotic makrofag lysis efter caspase-1 aktivering som beskrevet ovenfor. Denne anden metode er en befolkning-baseret tilgang, da udgivelsen af LDH i hele godt måles. Denne simple metode giver mulighed for hurtig analyse (30 min. i inkubationstiden) prøver at afgøre, om der er caspase-1-medieret celledød og kan udføres i et format, 96-brønd plade.
Disse metoder er komplementære, hver med forskellige fordele, og begge er let åbne over for ændringer. For eksempel kan makrofag behandling med målrettet små molekylvægt forbindelser før inflammasome stimulation bruges til at undersøge rollen visse proteiner kan have på at kontrollere inflammatoriske respons.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette håndskrift, har vi fremlagt to teknikker til at undersøge inflammasome aktivering og konsekvens af caspase-1 aktivering efter NLRP3 stimulation i murine knoglemarv-afledte makrofager. Den første teknik gør det muligt for forskeren til at fastslå omfanget af caspase-1 aktivering på cellulære grundlag bruger de fluorescerende reporter FAM-YVAD-FMK. Denne journalist er meget specifikke for bindende caspase-1 familie af enzymer, som ses ved fravær af farvning i caspase-1/11 mangelfulde makrofager. Specificite…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alle mikroskopi blev gjort på W. M. Keck mikroskopi Center med støtte af Nathaniel Peters og med støtte af NIH award S10OD016240. S.L.F. er støttet af NIH K08AI119142 og R21AI130281. Vi takker Dr. Richard Flavell og Dr. Brad Cookson for caspase-1/11 mangelfuld mus og Dr. Brad Cookson til deling af laboratoriefaciliteter og udstyr.
Materials
| E-MEM | ATCC | 30-2003 | For growing L929 cells |
| NCRC clone 929 (L929) | ATCC | CCL-1 | |
| Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde |
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay | Fisher Scientific | PR-G1780 | Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid |
| FAM-YVAD-FMK | Immunocytochemistry Technologies | 98 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Invitrogen | 11960044 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium | Invitrogen | 14190144 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin | Invitrogen | 26140079 | Heat inactivated at 55°C for 50 min |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| ProLong Gold Mounting Medium | Invitrogen | p36934 | Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46 |
| goat anti-mouse ALEXA555 | Invitrogen | A-21422 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Invitrogen | 11344041 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| TO-PRO-3 Iodide | Invitrogen | T3605 | far-red fluorescent nucleic acid stain |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratoy | 000664 | |
| caspase-1/11-/- mouse | Jackson Laboratory | 016621 | |
| Leica SP8X Confocal Microscope | Leica | ||
| Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) | List Biologicals | 434 | |
| anti-ASC clone 2EI-7 | Millipore-Sigma | 04-417 | |
| beta-mercapto-ethanol | Millipore-Sigma | M6250-10ML | |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650-5X10ML | |
| EDTA | Millipore-Sigma | E5391 | |
| Spectramax M3 plate reader | Molecular Devices | 5000414 |
References
- Jorgensen, I., Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).
- Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. T. Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat Rev Microbiol. 7 (2), 99-109 (2009).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cell Microbiol. 8 (11), 1812-1825 (2006).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., den Hartigh, A. B., Loomis, W. P., Cookson, B. T. Coordinated host responses during pyroptosis: caspase-1-dependent lysosome exocytosis and inflammatory cytokine maturation. J Immunol. 187 (5), 2748-2754 (2011).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Sutterwala, F. S., Haasken, S., Cassel, S. L. Mechanism of NLRP3 inflammasome activation. Ann N Y Acad Sci. 1319, 82-95 (2014).
- Juliana, C., et al. Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation. J Biol Chem. 287 (43), 36617-36622 (2012).
- Py, B. F., Kim, M. S., Vakifahmetoglu-Norberg, H., Yuan, J. Deubiquitination of NLRP3 by BRCC3 critically regulates inflammasome activity. Mol Cell. 49 (2), 331-338 (2013).
- Song, N., et al. NLRP3 Phosphorylation Is an Essential Priming Event for Inflammasome Activation. Mol Cell. 68 (1), 185-197 (2017).
- Stutz, A., et al. NLRP3 inflammasome assembly is regulated by phosphorylation of the pyrin domain. J Exp Med. 214 (6), 1725-1736 (2017).
- Broz, P., Dixit, V. M. Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling. Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).
- Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).
- Yamamoto, M., et al. ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules. Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).
- Miao, E. A., Rajan, J. V., Aderem, A. Caspase-1-induced pyroptotic cell death. Immunol Rev. 243 (1), 206-214 (2011).
- LaRock, C. N., Cookson, B. T. The Yersinia virulence effector YopM binds caspase-1 to arrest inflammasome assembly and processing. Cell Host Microbe. 12 (6), 799-805 (2012).
- Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect Immun. 63 (9), 3609-3620 (1995).
- Miller, S. I., Ernst, R. K., Bader, M. W. LPS, TLR4 and infectious disease diversity. Nat Rev Microbiol. 3 (1), 36-46 (2005).
- Sester, D. P., et al. A novel flow cytometric method to assess inflammasome formation. J Immunol. 194 (1), 455-462 (2015).
- Sester, D. P., et al. Assessment of Inflammasome Formation by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2016).
- DiPeso, L., Ji, D. X., Vance, R. E., Price, J. V. Cell death and cell lysis are separable events during pyroptosis. Cell Death Discov. , (2017).
- Russo, H. M., et al. Active Caspase-1 Induces Plasma Membrane Pores That Precede Pyroptotic Lysis and Are Blocked by Lanthanides. J Immunol. 197 (4), 1353-1367 (2016).
- Evavold, C. L., et al. The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages. Immunity. , (2017).
