Micromanipulation des Chromosomes dans les Spermatocytes insectes

Micromanipulation a révélé des pièces du mécanisme pour une chromosome congression, la broche checkpoint et mouvements de chromosome de l’anaphase. La première publication décrivant les résultats des expériences de micromanipulation était par Robert Chambers¹. Chambers a utilisé un micromanipulateur mécanique avec une aiguille de verre ci-joint pour sonder le cytoplasme d’un certain nombre de différents types cellulaires. Malheureusement, les méthodes de contraste permettant la visualisation des chromosomes et de nombreux autres composants cellulaires dans les cellules vivantes n’étaient pas disponibles dans le temps, donc expériences Chambers’ impossible d’afficher les effets de ces composants cellulaires de repositionnement. Micromanipulations précoces qui a modifié la position chromosomique utilisé l’appareil Chambers à balayer le milieu de la broche dans les cellules de l’anaphase, montrant que ces manipulations pourraient modifier la position des bras chromosomiques en neuroblastes sauterelle de l’anaphase² . Nicklas et ses collaborateurs furent les premiers à effectuer des micromanipulations fines des chromosomes, qui s’étend des chromosomes³, détacher de la fusée et induisant une réorientation^3,4, stabiliser une malorientation en appliquant la tension pour les chromosomes^5,6,7et en mesurant les forces produites par pivots en anaphase^8,9. Autre travaux par le laboratoire de Nicklas ont montré que les granules cytoplasmiques pourraient également être manipulé¹⁰ et que les centrosomes pourraient être réorientées en micromanipulation¹¹. Micromanipulation n’est pas seulement utile pour déplacer des chromosomes et autres composants cellulaires. Une aiguille de micromanipulation peut couper proprement un fuseau mitotique dans demembranated cellules¹² ou peut être utilisée pour dissoudre l’ enveloppe nucléaire¹³. En outre, les cellules adjacentes peuvent être fusionnés par micromanipulation^14,15.

Avec une telle variété d’expériences intéressantes qui peut être fait à l’aide de micromanipulation, c’est à première vue surprenant que micromanipulation expériences ont été faites par très peu de biologistes du chromosome. Une des raisons de cette carence, c’est que les cellules cultivées de division mitotique qui sont dérivées de tissus vertébrés et sont couramment utilisés pour l’étude des mouvements des chromosomes sont extrêmement difficiles à micromanipulate. Ces cellules de culture de tissu ont généralement un cytosquelette cortical que « obtient de la manière » de la micromanipulation aiguille et chromosomes non plus n’est pas joignable par l’aiguille ou Marc de l’aiguille à travers la cellule, conduisant à une rupture de cellules et de la mort. Autres expérimentateurs qui utilisent la micromanipulation, et nous avons trouvé arthropodes cellules à se prêter à la micromanipulation. Les spermatocytes arthropodes sont facilement se propager sous une couche de Huilehalocarbone et semblent avoir un cytosquelette cortical beaucoup moins robuste qui sous-tendent la membrane cellulaire au cours d’une division cellulaire. Ainsi, les testicules arthropodes constituent une bonne source de cellules de division de méiose (spermatocytes) et de division mitotique des cellules (spermatogonies) avec des chromosomes facilement accessibles pour la micromanipulation. Une série de sectionnement d’un spermatocyte sauterelle fixé pendant une manipulation a révélé que l’aiguille pénètre jamais dans la membrane cellulaire ; la membrane cellulaire se déforme autour de l’aiguille (Nicklas R.B., communication personnelle). Les spermatocytes de plusieurs taxons d’insectes et araignées ont été micromanipulés avec succès, y compris les sauterelles, les Mantes priant, drosophiles, tipules, grillons, cercopes, papillons, araignées veuve noire, cave araignées et orb-weaving spiders ^{3,7,17,18,19,20,21,22}. Des cellules cultivées, facteur de division mitotique des insectes peuvent être micromanipulés. Par exemple, les chromosomes en neuroblastes sauterelle dans une culture primaire ont des chromosomes qui peuvent être facilement micromanipulés^2,23. Nous soupçonnons que la disposition cultivés lignées dérivées de drosophile et autres insectes seront également micromanipulatable, bien que nous n’avons pas testé la technique avec ces cellules. Nous allons montrer comment diviser des cellules de sauterelles et les grillons peut être préparé pour une micromanipulation. Grillons sont faciles à obtenir de la plupart des magasins pour animaux de compagnie à tout moment de l’année. Les sauterelles ne sont faciles à obtenir en été à moins que le chercheur a accès à une colonie de laboratoire, mais l’espèce utilisée (Melanoplus sanguinipes) a aplani facilement les cellules et longs, facile-à-manipuler les chromosomes.

Une autre raison pourquoi les expériences de micromanipulation ont été faites par une petite poignée de biologistes est que micromanipulateurs qui bougent bien les chromosomes sont rarement disponibles sur le marché. Nous avons constaté qu’un micromanipulateur piézoélectrique contrôlées par manette contrôle le mouvement de l’aiguille sans vibration, dérive, ou le décalage entre les mouvements de la manette et le déplacement de l’aiguille, mais les autres types de manipulateurs peuvent pousser aussi avec succès des chromosomes autour de la cellule. Les micromanipulateurs conçus par Ellis et Begg^25,26 sont idéales pour la micromanipulation des chromosomes, bien qu’elles utilisent la technologie plus ancienne. Micromanipulateurs PIEZO-ELECTRIQUE sont actuellement disponibles et couramment utilisés en électrophysiologie ; Toutefois, ces micromanipulateurs ne sont pas généralement contrôlée par joystick. Contrôle de manette de jeu est essentielle pour le mouvement lisse d’une micromanipulation réussie, et donc une manette de jeu personnalisé doit être construite pour faire les micromanipulateurs PIEZO-ELECTRIQUE actuellement disponibles fonctionnent pour une micromanipulation de chromosome. Les micromanipulateurs piézoélectriques contrôlées par joystick qui fonctionnent le mieux ont contrôle de position directe, où le mouvement du levier de commande se traduit directement à un déplacement de l’aiguille.

Un micromanipulateur piézoélectrique nouvellement conçu peut être construit de pièces disponibles sur le marché qui peuvent être facilement remplacés et de quelques petits composants imprimés 3D, et il fonctionne bien pour le chromosome micromanipulation²⁴. Le micromanipulateur n’a sensibilité réglable, positionnement manuel grossier et aucune vibration, dérive ou retard dans le mouvement de l’aiguille et le contrôle direct de position de l’aiguille. Les scientifiques peuvent construire le micromanipulateur à l’aide d’instructions disponibles en ligne²⁴. Voici les méthodes de préparation d’une culture de cellules de spermatocytes primaires et pour micromanipulating les chromosomes dans les cellules de cette culture.