Summary

Folgenden endokardialen Gewebe Bewegungen über Zelle Ladungszustand des Zebrafish Embryos

Published: February 20, 2018
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für den Ladungszustand Kaede fluoreszierenden Proteins in endokardialen Zellen der lebenden Zebrafischembryo, die es die Verfolgung von endokardialen Zellen während der ventrikulären Kanal und ventrikulären Herz-Ventil-Entwicklung ermöglicht .

Abstract

In der Embryogenese Zellen durchlaufen dynamische Veränderungen der Zelle Verhalten und Entschlüsselung der zellulären Logik hinter diesen Veränderungen ist ein grundlegendes Ziel auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie. Die Entdeckung und Entwicklung von Photoconvertible Proteinen haben unser Verständnis dieser dynamischen Veränderungen durch die Bereitstellung einer Methode auf, um optisch markieren Sie Zellen und Gewebe unterstützt. Jedoch während Ladungszustand, Time-Lapse-Mikroskopie und anschließende Bildanalyse sich sehr erfolgreich bei der Aufdeckung zelluläre Dynamik in Organe wie das Gehirn oder das Auge als haben, diesen Ansatz dient in der Regel nicht in den Entwicklungsländern Herz Herausforderungen durch die schnelle Bewegung des Herzens während der Diastole. Dieses Protokoll besteht aus zwei Teilen. Der erste Teil beschreibt ein Verfahren zur Photoconverting und anschließend tracking endokardialen Zellen (EDZ) im Zebrafisch ventrikulären Kanal (AVC) und ventrikulären Herz-Ventil-Entwicklung. Die Methode beinhaltet zeitlich stoppen das Herz mit einem Medikament in Reihenfolge für genaue Ladungszustand stattfinden. Herzen sind wieder erlaubt schlagen nach dem Entfernen der Drogen- und Embryonalentwicklung wird normal fortgesetzt, bis das Herz wieder für die hochauflösende Darstellung von Photoconverted EDZ einen Zeitpunkt später Entwicklung gestoppt wird. Der zweite Teil des Protokolls beschreibt eine Analysemethode Bild um die Länge einer Photoconverted oder nicht Photoconverted Region in AVC in jungen Embryonen zu quantifizieren, indem Sie das Fluoreszenzsignal aus der dreidimensionalen Struktur auf eine zweidimensionale Karte zuordnen . Zusammen, die beiden Teile des Protokolls ermöglicht zu prüfen, die Herkunft und das Verhalten von Zellen, aus denen der Zebrafisch AVC und ventrikulären Herzklappe und können potenziell studierst Mutanten, Morphants oder Embryonen, die mit behandelt wurden beantragt werden Reagenzien, die AVC und/oder Ventil Entwicklung stören.

Introduction

Der Zebrabärbling ist derzeit eines der wichtigsten vertebrate Modelle, Zell- und Entwicklungsbiologie Prozesse in Vivozu studieren. Dies ist vor allem wegen der Zebrabärbling optische Transparenz und Hilfsbereitschaft, Genetik, wodurch es ein leistungsfähiges Modell für die Anwendung von optischen Techniken genetisch codierte Photoresponsive Protein Technologien1. Speziell für die Untersuchung der Entwicklung von Herz, Zebrafisch erhalten genügend Sauerstoff durch Diffusion, so dass auch Mutanten ohne Herzschlag durch die ersten Wochen der Entwicklung, überleben können Analysen über die Auswirkungen von Entwicklungsgenen und verstört bei schönem Durchblutung am Herzen Morphogenese in die meisten Wirbeltiere2nicht möglich.

Die Zebrafisch Herz Röhre wird durch 24 Stunden Post Düngung (hpf) gebildet. Kurz nach ihrer Gründung fängt das Herz Rohr aktiv zu schlagen. Von 36 hpf, eine deutliche Einschnürung trennt das Atrium aus dem Ventrikel. Diese Region der Verengung ist ventrikulären Kanal (AVC) und Zellen in dieser Region Änderung von einem Plattenepithelkarzinom Morphologie zu einem quaderförmigen Morphologie3genannt. Zebrafisch ventrikulären Ventil Morphogenese beginnt etwa 48 h post Düngung. Durch 5 Tage nach Befruchtung, zwei Klappensegel erstrecken sich in der AVC und verhindern den Rückfluss des Blutes aus dem Ventrikel in den Vorhof während der Diastole4. Tracking-Zellen bei AVC und Ventil Bildung ist anspruchsvoll, da die schnellen Schläge des Herzens es schwierig macht, Zellen über traditionelle Zeitraffer Mikroskopie5,6folgen. Dieses Protokoll, adaptiert von Ross Et Al., 20167, beschreibt eine Methode, die Tg (Fli1a:gal4FFUbs, UAS:kaede)8 Zebrafisch transgene Linie, in der das Photoconvertible Protein Kaede in ausgedrückt wird Endothelzellen, einschließlich des Endokards. Die Droge 2,3-Butanedione-2-Monoxime (BDM) wird verwendet, um das Herz zu schlagen, so dass genaue Ladungszustand des EDZ zwischen 36 und 55 hpf und hochauflösende Bildgebung des Photoconverted EDZ an bestimmten Entwicklungszeit stellen vorübergehend zu stoppen. Es hat bisher gezeigt, dass EDZ Photoconverted mit dieser Methode für mindestens fünf Tage nach dem Zeitpunkt der Ladungszustand7unterscheidbar von den Unbekehrten Nachbarn bleiben kann. Dieses Protokoll beschreibt auch eine Methode für die Bildanalyse der Photoconverted EDZ in Embryonen, die jünger als 48 hpf, die erfolgreich verwendet wurde, um Gewebe Bewegungen während AVC Entwicklung (Boselli Et Al., im Druck)9folgen. Wir hoffen, dass die Leser dieses Protokoll nützlich finden würde, für AVC und Ventil Entwicklung in normalen Embryonen und Mutanten, Morphants oder Medikament behandelten Embryonen zu studieren. Lesen Sie für eine allgemeinere Protokoll in Bezug auf Zelle Tracking mit Photoconvertible Proteinen während der Zebrafisch-Entwicklung bitte den Artikel von Lombardo Et Al., 2012-10.

Protocol

1. Vorbereitung Formen und Montage agarose Erstellen Sie eine Form mit den Maßen, die in Abbildung 1 mit einem 3D Drucker oder traditionelle mechanische Werkstatt Werkzeuge dargestellt. Pipette ca. 1,5 mL geschmolzene 1 % Agarose in eine Schale 35 mm Kunststoff Montage. Legen Sie den Kunststoff-Formenbau in die flüssige Agarose, kümmert sich um Trapping Luft zwischen der Form und der Agarose zu vermeiden. Legen Sie die Schale bei 4 ° C, warten Sie, bis die Agarose hä…

Representative Results

Ein Beispiel für ein Embryo Photoconverted um 48 hpf und wieder bei 80 hpf ist in Abbildung 2, Filme 1 und 2dargestellt. Kaede irreversibel 405 nm Licht aussetzen in Bezug auf ihre differentiell farbigen Konvertiten aus dem Protein aus seiner fluoreszierende grüne Form, fluoreszierende rote Form, damit das Verhalten von Zellen mit entweder grün oder ihre rote Form mit einzuhaltenden beschriftet Nachbarn bei Ventil-Bildung….

Discussion

Timing der Ladungszustand: Obwohl Kaede bleibt hell ausgedrückt im EDZ sogar bei 96 hpf, ist anzumerken, dass der Embryo wächst, Laser-Licht mehr diffundiert bevor es die AVC, erschweren die engen Ladungszustand der Kaede erreicht. Bei embryonalen Stadien spätestens 55 hpf, Ballonfahren der Ventrikel und Atrium bedeutet auch, dass die violetten Laserstrahl verwendet für Ladungszustand AVC Zellen ohne ersten Durchgang durch die Atrium oder Ventrikel erreichen kann. Dies bedeutet, dass über 55 hpf, um zu Phot…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten danken Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli und Basile Gurchenkov für die Hilfe, konstruieren und fertigen die Form, die in diesem Protokoll beschrieben. Diese Arbeit wurde von der Europäischen Gemeinschaft, ERC CoG N ° 682938, EMBO Young Investigator Program, die ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), FRM (DEQ20140329553) unterstützt Evalve und geleitet durch den Zuschuss ANR-10-LABX-0030-INRT, ein französischer Staatsfonds die Agence Nationale De La Recherche unter dem Rahmen Programm Investissements Avenir beschriftet ANR-10-IDEX-0002-02.

Materials

Materials
Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details).
Stereomicroscope
Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) Leica Leica SP8
Heat block ThermoScientific 88870001
35 mm x 10 mm tissue culture dish Falcon 353001
6 well plate Falcon 353046
Petri dish
Forceps
Glass pipette
Mold
Reagents
8 mg/mL Tricaine stock solution 
1 M BDM stock solution
UltraPure low melting point agarose Invitrogen 16520-050
Agarose Lonza 50004
PTU (1-phenyl-2-thiourea) Sigma Aldrich P7629
Embryo medium: 30x stock solution
Software
Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes MathWorks
8 mg/mL Tricaine stock solution
200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) Sigma-Aldrich E10521
25 mL Danieau
Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C 
1 M BDM stock solution
1 g BDM Sigma-Aldrich 112135
10 mL ddH2O
Aliquot and store at -20 °C
Embryo medium: 30x stock solution
50.7 g NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
0.78 g KCl Sigma-Aldrich 7447-40-7
1.47 g Magnesium sulfate Sigma-Aldrich  7487-88-9
2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate Sigma-Aldrich 13477-34-4
19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) Sigma-Aldrich 7365-45-9
Adjust to pH 7.2 and store at room temperature
Mold
PlasCLEAR resin Asiga
Plus 39 Freeform Pico 3D printer Asiga

References

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Cite This Article
Chow, R. W., Lamperti, P., Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (132), e57290, doi:10.3791/57290 (2018).

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