Summary

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Published: April 20, 2018
doi:

Summary

תקשורת זו מתארת מתודולוגיות בידוד ותרבות של מקרופאגים מכתשי מבני ומודלים מאתר למטרות ניסוי.

Abstract

עיצור מכתשי, מקרופאגים הם מקרופאגים סופני הבדיל, ריאות-תושב ממוצא טרום לידתי. מקרופאגים מכתשי הייחודיות שלהם חיים ארוכים, שלהם תפקיד חשוב פיתוח ריאות ו פונקציה, וכן מותאם לשפות אחרות ריאות התגובות שלהם זיהום ודלקת. נכון להיום, אין שיטה אחידה זיהוי, בידוד של טיפול של מקרופאגים מכתשי מן בני אדם ועכברים קיימת. השיטה יש צורך במחקרים על אלה תאים חיסוניים מולדת חשוב במסגרות שונות ניסיוני. השיטה המתוארת כאן, אשר יכולים לאמץ בקלות על ידי כל מעבדה, היא גישה מפושטת קציר מקרופאגים מכתשי נוזל שטיפה bronchoalveolar או רקמת הריאה, שמירה על אותם בתוך חוץ גופית. מאחר מקרופאגים מכתשי מתרחשים בעיקר בתור תאים חסיד של alveoli, המיקוד של שיטה זו הוא על הם מוציאים אותם לפני הקציר וזיהוי. הריאה הוא איבר מאוד vascularized, סוגי תאים שונים של תאים מיאלואידים ומקור הלימפה המאכלסים, אינטראקציה, והם מושפעים microenvironment הריאה. באמצעות הסט של סמני פני השטח המתואר כאן, חוקרים יכולים בקלות באופן חד משמעי להבדיל מקרופאגים מכתשי לבין אחרים לויקוציטים, לטהר אותם ליישומים במורד הזרם. שיטת תרבות פיתח בזאת תומך אנושיים והן העכבר מקרופאגים מכתשי לצמיחה בתוך חוץ גופית ו תואמת ללימודי תאית ומולקולרית.

Introduction

Microenvironment ריאות הוא מערכת אקולוגית מורכבת באופן ייחודי עם צינור אוויר משוכללים, להערכת. האוויר הנשאף נוסע דרך קנה הנשימה ודרך אינספור ענפי הסמפונות bronchioles לפני שהגיע alveoli, שבו מתרחשת ההחלפה גז דם-אייר. עקב אינטראקציה ישירה עם האווירה, השטח הנשימה מחייבת הגנה מפני השפעות מזיקות של חלקיקים מוטס מזהמים. מספר המחסומים פיזי, כימי, אוטואימונית להגן על הריאות. ראוי לציין, פריסה של phagocytes על פני הנשימה מגישה מערכת ההגנה קו ראשון חשוב. מכתשי מקרופאגים (AMs) הן סוג אחד של phagocytes ריאות תושב, הם מהווים את הרוב המכריע של הבריכה מקרופאג ריאות. כפי שמרמז שמם, AMs המותאמות לשפה בעיקר לומן מכתשי, להתרחש כמו תאים sessile כל הזמן לטעום את האווירה הסביבתית ולתקשר עם האפיתל מכתשי1. מצב יציב בריאות יותר מ 95% של phagocytes בחלל מכתשי הם AMs2, של מי הרכב עשוי לשנות עקב דלקת, זיהום או חשיפה כרונית לחומרים מזהמים.

AMs להשתתף במגוון רחב של פונקציות שעשויות להיות מקומי אל הריאות ו/או חשיבות מערכתית. לדוגמה, AMs חיוניים להתפתחות ולתפקוד מיטבי של הריאות; מעקב המערכת החיסונית; סיווג של פסולת הסלולר, פתוגנים פולשים, בשאיפה חלקיקים3,4,5,6,7. דלדול יישוב של AMs ידוע לפגום סיווג של הנשימה וירוסים, חיידקים4,8. מלבד להיותם phagocytes ולוחמים השורה הראשונה של הומאוסטזיס ריאתי, AMs ידועים לתפקד כתא תאים אנטיגן הצליחו יותר במשיכת T חסינות9, potentiating את היעילות של החיסון תוך-אפי10 ו המשפיעים על מחלת חיסון עצמי בעל הגבלת הריאות אחרי11,השתלת ריאות12. ליקוי בתפקוד AM נקשר proteinosis מכתשי ריאתי (PAP), מצב הנובע מוטציה גנטית, ממאירות או זיהום זה פוגע סיווג פיתחה ריאתי13,14. עכשיו הוא להיות חקר השתלת של AMs כמו גישה טיפולית לטיפול של PAP 15,16.

AMs ידועים מקורם במהלך מופרה, מתעקש הריאות לאורך החיים מבלי להיות מוחלף על ידי במחזור לויקוציטים2,17. אמנם, מחזור AM לגילוי homeostatic בריאות, רמות משתנות של מחזור AM דווחו בתנאים מסוימים קליני כולל זיהום על ידי וירוס שפעת4, הקרנה myeloablative18, חשיפה אנדוטוקסין 19, לגיל20. AMs האמינו לחדש עצמי באמצעות התפשטות בדרגה נמוכה17,21, אך מחקרים אחרונים טוענים כי ומונוציטים יכולים להצמיח אוכלוסיה של הריאה קרישה תוך-כלית מקרופאגים22,23 תחת תנאים ניסיוני, אבל הפונקציונליות של מקרופאגים ריאתי שהומר לאחרונה אלה טרם יוגדר על מחלות ריאה. יתר על כן, הבנת את סף הגירוי בהקשר של הפעלת AM היא אזור שעשוי להיות מעניין, כפי הריאה מנסה לשמור על איזון בין אותות דלקתיים המכונות immunoregulatory.

התיקונים הפיזיולוגיות או פיפטות להוביל לאובדן של ויסות מערכת החיסון חשובים להערכה במסגרות קליניות שונות (למשל, זיהומים בדרכי הנשימה, מחלות ריאה דלקתיות, מחלות ריאה שהותירה). למרות זאת, AMs מזוהים יותר ויותר מחוונים או אפילו גורמים של בריאות ריאתי11,24. כיום, ישנם פרוטוקולים מאוחד לא זמינה עבור קציר, אפיון, ו/או AMs לשמירה על בני אדם, במודלים מאתר פרה. היעדר קונצנזוס על סימנים מקדימים AM ו פנוטיפים ולאחר היעדרות של מתודולוגיה מפורט היה המחסום העיקרי בפיענוח תפקידים בבוקר על ריאות בריאות ומחלה. להלן כללי התנהגות מציע לנו זיהוי ודאי, בידוד, במבחנה אסטרטגיה תרבות מאוד לקדם את ההבנה של התנהגות AM, להקל על מחקרים האבחון והטיפול, ממוקדות AM.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על-ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים, שימוש הוועדה (IACUC), את המוסדיים סקירה לוח (IRB) בבית החולים סנט גוז’ף המרכז הרפואי. 1. בידוד של AMs של נוזל Bronchoalveolar מאתר שטיפה (BAL) להרדים על העכבר C57BL/6 בת שבוע 8 עם קטמין (87.5 מ”ג/ק”ג משקל גוף), חריגות השירותים הווטרינריי?…

Representative Results

הגישה cytometric זרימה כדי לזהות העכבר AMs מוצג באיור1. זה כולל ניתוח של ערכה מינימלית של הצורך בהבחנה AMs של אחרים phagocytes ריאות-תושב או ריאות הסתננות משטח סמנים. ניתוח דיפרנציאלית נדרש כדי לזהות באופן חיובי AMs של מקרופאגים אינטרסטיציאליות, תאים דנדריטים, נויטרופי?…

Discussion

AMs הם חיים ארוך ריאות תושב מקרופאגים that לאכלס את הריאות החל בלידה, ומתמשך לאורך כל תוחלת החיים26. תפקידיהם פיזיולוגיה ריאתי7 ופתולוגיה12 ו את הפוטנציאל שלהם כדי לנבא מחלת חיסון עצמי ריאתי24 זוהו. כי AMs יש נוכחות ארוכת טווח הריאות11</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים קלייר פרנדרגסט לקבלת סיוע בעריכה את כתב היד. DKN נתמך על ידי מחקר מענק (#2095) של קרן Flinn, TM נתמכת על ידי מענקים מכוני הבריאות הלאומיים (R01HL056643 ו- R01HL092514). DKN פיתחו את השיטות המחקר תוכנן, כתב היד; אום סייע עם מחקרים שנעשו בבעלי חיים והרכש הדגימה הקלינית; SB סייע עם זרימה cytometric ניתוח ומיון תא; TM ומפוקח המחקרים שנסקרו כתב היד.

Materials

Non-enzymatic cell dissociating solution Millipore-Sigma C5789
Puralube Vet Ointment Dechra 620300
22G Catheter  Terumo Medical Products SR-OX2225CA
4-0 Non-absorbable silk braided suture  Kent Scientific SUT-15-2
Dulbecco’s phosphate buffered saline  Corning 21-031-CM
Mouse Fc block  BD Biosciences 553142
Lysis buffer (PureLink RNA Kit) Thermo Fisher Scientific  12183018A
b-Mercaptoethanol  Millipore-Sigma M6250 
FACSAria II cell sorter  BD Biosciences 644832
Ketamine  (Ketathesia) Henry Schein 56344
Xylazine  (AnaSed) Akorn 139-236
RPMI 1640 Corning 10-040-CM
DMEM Corning 10-017-CM
Liberase TL  Millipore-Sigma 5401020001
DNase I Millipore-Sigma AMPD1-1KT
100μm cell strainer  Corning 352360
Human Fc block BD Biosciences 564220
EDTA Corning 46-034-CI
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific  AMQAX1000
Trypan Blue Solution Thermo Fisher Scientific  15250061
HEPES Corning 25-060-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150H
L-929 cell line American Type Culture Collection ATCC, CCL-1
Penicillin/Streptomycin  Corning 30-002-CI
Sodium Pyruvate Corning 25-000-CI
T25 Tissue culture flask Thermo Fisher Scientific  156367
60 mm culture dish  Millipore-Sigma CLS3261
15 mL Conical tube  Corning 352097
50 mL Conical tube  Corning 352098
LSRFortessa cell analyzer BD Biosciences 657669
FlowJo FlowJo v10.4 Analysis Software
Anti-CD45 (Mouse) Biolegend 147709 Clone I3/2.3, FITC conjugated
Anti-CD11b (Mouse) Biolegend 101228 Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated
Anti-CD11c (Mouse) BD Biosciences 565452 Clone N418, BV 421 conjugated
Anti-I-Ab (Mouse) Biolegend 116420 Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated
Anti-Siglec-F (Mouse) BD Biosciences 562757 Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated
Anti-Siglec-H (Mouse) Biolegend 129605 Clone 551, PE conjugated
Anti-F4/80 (Mouse) Biolegend 123118 Clone BM8, APC/Cy7 conjugated
Anti-Ly-6C (Mouse) Biolegend 128035 Clone HK1.4, BV605 conjugated
Anti-CD64 (Mouse) Biolegend 139311 Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated
Anti-CD24 (Mouse) BD Biosciences 563115 Clone M1/69, BV510 conjugated
Anti-CD103 (Mouse) BD Biosciences 745305 Clone OX-62, BV650 conjugated
Anti-CD317 (Mouse) Biolegend 127015 Clone 927, APC conjugated
Anti-CXCR1 (Mouse) Biolegend 149029 Clone SA011F11, BV785 conjugated
Anti-CD45 (Human) Biolegend 304017 Clone HI30, AF488 conjugated
Anti-CD11b (Human) Biolegend 101216 Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated
Anti-HLA-DR (Human) Biolegend 307618 Clone L243, APC/Cy7 conjugated
Anti-CD169 (Human) Biolegend 346008 Clone 7-239, APC conjugated
Anti-CD206 (Human) Biolegend 321106 Clone 15-2, PE conjugated
Anti-CD163 (Human) Biolegend 333612 Clone GHI/61, BV421 conjugated

References

  1. Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
  2. Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).
  3. Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells. PLoS Pathog. 13 (1), e1006140 (2017).
  4. Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections. J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).
  5. MacLean, J. A., et al. Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity. Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).
  6. Nakamura, T., et al. Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung. J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).
  7. Schneider, C., et al. Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection. PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).
  8. Pribul, P. K., et al. Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development. J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).
  9. Macdonald, D. C., et al. Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease. Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).
  10. Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV). Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).
  11. Nayak, D. K., et al. Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses. Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).
  12. Sekine, Y., et al. Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation. J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).
  13. Borie, R., et al. Pulmonary alveolar proteinosis. Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).
  14. Greenhill, S. R., Kotton, D. N. Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction. Chest. 136 (2), 571-577 (2009).
  15. Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113 (2014).
  16. Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
  17. Hashimoto, D., et al. Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes. Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).
  18. Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. The prolonged life-span of alveolar macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).
  19. Maus, U. A., et al. Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).
  20. Perdiguero, G. E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
  21. Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung. J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).
  22. Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. J Exp Med. , (2017).
  23. Zheng, Z., et al. Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction. Sci Transl Med. 9 (394), (2017).
  24. Nayak, D. K., et al. Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection. Sci Transl Med. 9 (398), (2017).
  25. Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).
  26. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
  27. Eguiluz-Gracia, I., et al. Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients. Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).
  28. Yu, Y. A., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).

Play Video

Cite This Article
Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. J. Vis. Exp. (134), e57287, doi:10.3791/57287 (2018).

View Video