Summary

Préparation du murin des glandes salivaires sous-maxillaires pour la microscopie intravitale verticale

Published: May 07, 2018
doi:

Summary

Les auteurs décrivent un protocole pour chirurgicalement exposer et stabiliser les glandes salivaires sous-maxillaires murine intravitale imagerie microscopie intravitale verticale. Ce protocole est facilement adaptable à d’autres glandes exocrines de la tête et la région du cou de la souris et autres petits rongeurs.

Abstract

La glande salivaires sous-maxillaire (SMG) est l’une des trois principales glandes salivaires et présente un intérêt pour nombreux domaines de la recherche biologique, immunologie, oncologie, médecine dentaire et la biologie cellulaire. Le SMG est une glande exocrine, constituée de cellules épithéliales sécrétrices, myofibroblastes, cellules endothéliales, nerfs et la matrice extracellulaire. Des processus dynamiques cellulaires chez le rat et la souris SMG ont précédemment été imagés, utilisant surtout inversé systèmes de microscopie multiphotonique. Nous décrivons ici un protocole simple pour la préparation chirurgicale et la stabilisation de la SMG murin souris anesthésiés pour l’imagerie in vivo avec des systèmes de microscope multiphotonique vertical. Nous présentons ensembles image intravitale représentative d’endogène et transféré Moutschen cellules fluorescentes, y compris l’étiquetage des vaisseaux sanguins ou des conduits salivaires et génération de seconde harmonique de visualiser de collagène fibrillaire. En somme, notre protocole permet une préparation chirurgicale des glandes salivaires de la souris dans les systèmes de microscopie verticale, qui sont couramment utilisés pour l’imagerie intravitale dans le domaine de l’immunologie.

Introduction

Salive est sécrétée par les glandes exocrines pour lubrifier les aliments, protéger les muqueuses des voies orale et pour fournir des enzymes digestives ainsi que des substances antimicrobiennes1,2. En plus des glandes salivaires intercalés dans la sous-muqueuse buccale, il y a trois ensembles bilatérales des glandes principales identifiées comme parotide, sublingual et sous-maxillaires, selon leur emplacement1,2. Cellules épithéliales en forme de pyramide, organisés dans des sacs en forme de fiole (acini) ou demilunes qui sont entourées de cellules myoépithéliales et une membrane basale, sécrètent les composants séreuses et muqueuses de salive1. L’espace étroit luminale des acini se déverse dans des conduits intercalés, qui s’unissent dans des conduits striés jusqu’à ce qu’ils rejoignent finalement dans un seul conduit excréteur1. Le conduit excréteur principal de la SMG est appelé canal de Wharton (WD) et s’ouvre sur la caroncule sublinguale3,4. Le compartiment épithélial SMG représente donc une structure très arborisée avec des points de terminaison terminales collecteurs, ressemblant à un paquet de raisins1,5,6. L’interstitium SMG est composé des vaisseaux sanguin et lymphatique, intégrés dans le tissu conjonctif7 contenant des nerfs parasympathiques8 et5de la matrice extracellulaire. Glandes salivaires normales humains et rongeurs contiennent également des cellules T, macrophages et cellules dendritiques9, ainsi que les plasmocytes sécrétant des immunoglobulines A (IgA) dans la salive9,10. En raison de ses fonctions aux multiples facettes de la santé et la maladie, la SMG est un sujet d’intérêt pour plusieurs domaines de la recherche biologique, y compris la dentisterie4, immunologie11, oncologie12,8de la physiologie et biologie cellulaire 3.

Imagerie des processus cellulaires dynamiques et interactions est un outil puissant dans la recherche biologique13,14. Le développement des tissus profonds d’imagerie et d’innovations inmicroscopes basées sur l’optique non linéaire (NLO), qui reposent sur la diffusion ou l’absorption de photons multiples par l’échantillon, a permis d’examiner directement les processus cellulaires en tissus complexes13 ,15. Absorption des photons multiple implique la livraison de l’énergie d’excitation totale de photons de faible énergie, quelle excitation de fluorophore limites au plan focal et permet donc une pénétration plus profonde des tissus avec le photovieillissement réduite et le bruit extérieur de mise au point excitation13,15. Ce principe est employé par microscopie biphotonique (14:00) et permet l’imagerie des spécimens fluorescentes dans les profondeurs de jusqu’à 1 mm15,16. Tandis que disponible dans le commerce 14:00 configurations sont devenus faciles à utiliser et fiable, le défi majeur pour l’imagerie intravitale est soigneusement exposer et stabiliser l’organe cible des souris anesthésiés, surtout pour l’imagerie de la série de laps de temps. Plusieurs méthodes pour la correction de dérive numérique après acquisition de données ont été publiées le17,18 et nous avons récemment mis au point « VivoFollow », un système de correction automatique, qui neutralise les tissus lente dérive en temps réel en utilisant un informatisé étape19. Toutefois, il est toujours essentiel pour haute qualité d’imagerie pour minimiser le mouvement tissulaire, en particulier les mouvements rapides causés par la respiration ou de battements cardiaques19. Procédures de préparation et de stabilisation ont été publiés pour plusieurs organes, dont la moelle épinière20foie21, peau22, poumon23et ganglion24. En outre, les modèles pour l’imagerie des glandes salivaires de rat ont été développés3,25 et peaufinées pour intravitale imagerie à haute résolution de la murine que SMG adapté à un microscope inversé installation26, 27 , 28.

Nous présentons ici un protocole pratique et adaptable pour l’imagerie de la SMG murine intravitale à l’aide de la microscopie non linéaire verticale, qui est couramment utilisée pour l’imagerie intravitale dans le domaine de l’immunologie. À cette fin, nous avons modifié une scène largement indépendants immobilisation utilisée pour les préparations de ganglions poplités.

Protocol

Tout travail animal a été approuvé par le Comité Cantonal pour l’expérimentation animale et réalisé selon les lignes directrices fédérales. 1. anesthésier la souris Porter des équipements de protection individuelle, y compris les gants et blouse de laboratoire. Mélanger la kétamine, xylazine et une solution saline à une concentration de travail de 20 mg/mL et 1 mg/mL, respectivement. Injecter le stock de travail par voie intrapéritonéale (i.p.) à 8-10 µL…

Representative Results

Ce protocole permet l’imagerie de presque l’ensemble côté dorsal ou ventral de la SMG. Généralement, le champ de vision inclut également la glande salivaire sublinguale, qui diffère légèrement de la SMG en composition cellulaire4. Les deux glandes sont encapsulées par collagène fibrillaire et divisés en lobes. La plupart 14:00 systèmes peuvent produire une image exempte d’étiquette de collagène fibrillaire en mesurant le signal harmonique 2…

Discussion

Ce protocole propose une approche simple pour l’imagerie in vivo des glandes salivaires sous-maxillaires et sublinguales murines microscopie non linéaire verticale souvent utilisés dans le domaine de l’immunologie. La méthode peut être adaptée pour l’imagerie des autres glandes exocrines dans la région de la tête et du cou. Par exemple, notre laboratoire a réaliser l’imagerie de la glande lacrymale de manière analogue (non illustrée).

Enlever le tissu conjonctif auto…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par la Fondation National Suisse (FNS) projet grant 31003A_135649, 31003A_153457 et 31003A_172994 (pour JVS) et Leopoldina bourse 2011 DFP-16 (BS). Ce travail a bénéficié des configurations optiques du « Microscopie Imaging Center » (MIC) de l’Université de Berne.

Materials

Narketan 10 %  (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) Vetoquinol 3605877535982
Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) Bayer 680538150144
Saline NaCl 0.9% B. Braun 3535789
Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) Fatro 6805671900029
Electric shaver Wahl 9818L or similar
Hair removal cream Veet 4002448090656
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-1
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-0
Super glue Ultra gel, instantaneous glue Pattex, Henkel 4015000415040
Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm Menzel-Gläser 631-1343/ 631-1344
Grease for laboratories 60 g glisseal N Borer (VWR supplier) DECO514215.00-CA15
Surgical scissors Fine Science Tools (F.S.T ) 14090-09 or similar
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T ) 11252-20 or similar
Cotton swab Migros 617027988254 or similar
Gauze Gazin 5 x 5 cm Lohmann and Rauscher 18500 or similar
Stereomicroscope Leica MZ16 or similar
Texas Red dextran 70kDa  Molecular Probes D1864
Cascade Blue dextran 10kDa invitrogen D1976
Two-photon system LaVision Biotec TrimScope I and II or similar
XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective Olympus n/a or other water immersion objective 
Digital thermometer Fluke 95969077651

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Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57283, doi:10.3791/57283 (2018).

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