ここでは、自己組織化ペプチドのひと関節軟骨細胞の脱分化型軟骨への分化を促進する足場の 3 D 培養システムを取得するためのプロトコルを提案する.
自己組織化ナノファイバーの三次元 (3 D) の足場に細胞を培養するための便利な方法を説明します。この培養システムは、非偏光組織の構造的特徴によく似た環境を再現します。さらに、足場の特定の組み込みナノファイバー構造、透明視覚的な光、顕微鏡の下でサンプルの簡単な可視化を可能にします。この利点は、特定の染料やプローブの染色による細胞遊走・組織、増殖と分化・従って彼らの特定の細胞機能の開発を研究に使用された主。さらに、この作業で簡単に軟骨組織に展開された人間の関節軟骨の再分化を研究するこのシステムの良好なパフォーマンスをについて説明します。細胞が自己ペプチドの足場の組み立てにカプセル化され、軟骨分化を促進するため、特定の条件下で培養しました。三次元培養実験の 4 週間の間に良い生存率を示した。予想通り、培養軟骨細胞誘導因子 (非誘導コントロールと比較して) のサンプル (これは高い軟骨の細胞外マトリックスに存在するグリコサミノグリカン (Gag) の汚れ) トルイジン ブルー強く陽性し、表現コラーゲンを含む特定の分子マーカーは、西部のしみの分析によると I、II、X を入力します。このプロトコルは、簡単に実行し、産業研究所と実験室のコースで教育の目的のために使用できます。
数十年、哺乳類の細胞の文化は非生理的な側面に関係なく実用的、経済的問題のため古典的な 2次元 (2 D) 培養システムを用いた実験の条件下で実行されています。この培養系は、勉強し、最も細胞の分子機構を理解するのに役立ちます、我々 知って今日より複雑な細胞システムを勉強する新しい細胞文化パラダイムが必要であります。したがって、三次元 (3 D) 培養システム、生物物理学、生体力学的微小環境を再作成するために必要な生物学的自然組織のそれに類似。近年、3次元培養システム、一般となっている研究者や業界の間で流行研究の新しいモデルを表すのでまたはセルをすることができますスペースで成長、細胞間を作成または細胞-マトリックスの相互作用のスクリーニングに移行し、最終的に特定の細胞系統に分化します。
この方法論の全体的な目標は、体外細胞微小環境生体内微小環境に近いを再作成することです。特に、合成の自己組織化ペプチド足場 (SAP) は独自のプロパティを持つ生体材料の種類作ったペプチド力学的特性の間の弱い相互作用と同様自然な細胞外マトリックスのナノサイズ気孔のネットワークを形成します。つまり、この物質の使用の背後にある合理性は本当に 3 D 環境を作成それを擬似 3次元組織や臓器単位の取得に最適です。しかし、最も重要なは、3 D のコンテキストにより、通常は存在しない二次元文化のプラットフォームのような組織構造、物質移動現象に関連するプロパティへの細胞の新しい生物学的機能を得るために 3 D 構造と最終的に組織の形態形成、今後の研究で機能的な組織・臓器1,2の開発の重要な要因であります。また、SAP の (コラーゲン、マトリゲル) 自然相手以上の利点は常温で非常に安定していてポスト プロダクション、配布またはストレージ3,4,のための特別な条件を必要としません。5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. 液汁は簡単な操作で必要なとき3 D ジェル イオン強度を増やすことによってまたは中立1,2に pH を調整することによって単に得られます。最後に、ここで説明した方法論は維持、成長、そして数セルなど、軟骨細胞、肝細胞、血管内皮細胞、骨芽細胞、神経細胞と同様の分化を促進するために広く使用された生体外でされています。胚と体細胞の幹細胞3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. 本研究では前述11軟骨様組織に人間の拡張された関節軟骨 (ハック) を区別するために 3 D 培養システムの使用について述べる。
ここでは、SAP を使用して 3 D システムでの培養細胞に対するメソッドを説明します。この合成の生体材料で細胞は自己組織誘導されその後、ペプチドのソリューションと混合では最初セルの周りナノメートル寸法のネットワークを作成し、したがって、真の 3 D 環境 (図 1) を作成します。細胞挙動はマトリックス剛性値 (すなわち拡散・移行・分化) によって影響を受けることを考慮することが重要です。したがって、一般的な方法論的制御は、同じ剛性値 (2 つの次元に文化) を持つペプチドの足場の上に細胞を培養することです。
以前は、私達のグループと他の人はさまざまな細胞システム3,4,5,6,7,8 三次元 (3 D) 文化のプラットフォームの使用を説明しました。、9,10、11,12,13,14,15。現在の仕事では、簡単で信頼性の高い方法を述べる三次元培養を取得のシステム機能を細胞、胚または大人の任意の種類を含む哺乳類セルの任意の型に適用される幹細胞、または機能不全の細胞がから分離された最終的には、生検、腫瘍などの.さらに、独立して、幹細胞は、胚や大人の場合彼らがない、リネージュ コミットメント能力に優れている古典的な 2D 文化料理10、11,12より 3 D 環境で 13,14,15。したがって、このシステムの細胞培養は、毒性学的及び薬理学的プラットフォームに修復や再生医学から、別のアプリケーションで使用できる機能の組織のような構造に分化に 。
細胞の微小環境は matrix 構造体と生体力学的、生物物理学的、生物学的パラメーターの面で自然な組織に似ているので、我々 は細胞機能の明確な利得を示しています。それにもかかわらず、システムが複雑になると、する必要があるパラメーターの数規制も増加、(物質移動現象に関連する問題を回避するアクティブな灌流システムなど外部サポート プラットフォームの必要性を含む).三次元培養細胞を移行、増殖、分化などの本質的な活動を規制する面でより良い実行します。彼らは、成長と 3 D での差別化の重要な結果ははるかに強化された細胞のクロストークが可能な複雑なネットワークを形成できます。樹液という事実が効果の合理的な研究から利点を足場 (成長因子、多糖類または通知に追加された各コンポーネントの生産それは細胞外マトリックス蛋白質表すと同様の培養条件作成ペプチド) が簡単に実施できます。
コラーゲン タイプ I およびマトリゲルなど他の自然な足場と比較して SAP の使用の明確な利点は、次: 1) SAP がバッチからバッチ生産に変化が少なく合成生体材料2) SAP; 特定のペプチドをモチーフに機能する容量があります。・ 3) SAP プレゼント生分解性低生体外で時間をかけて同じ生物物理学的、生体力学的、構造のプロパティを持つ 3 D 構造の維持を可能にします。対その他の使用制限がただし、樹液足場に細胞が低 pH による敵対的な環境の中で、カプセル化のステップの間にあります。したがって、これは記述の方法論の重要なステップです。さらに、実験を開始する前に特定のセル タイプごとに SAP 濃度を設定することが重要です。これは、実際には、細胞を培養しているまたはこれらの生体材料に特定のセル タイプごと最適な生体力学的成長条件が表示されますので、必須。
最後に、設計と生体材料足場のこのタイプの試作がに対するより良い治療法を開発する製薬業界を支援するより生理学的で信頼性の高い 3 D 組織モデルの開発を高めるだろうと考えてください。再生医療、癌または任意の治療。
The authors have nothing to disclose.
著者によって実行される研究は助成契約第 229239 の下で欧州連合第 7 フレームワーク プログラム (FP7/2007-2013) と、探索的研究共同研究プログラム急性 AO 財団からの助成金によって部分で支えられました軟骨損傷/病変/欠陥 (CRP ACI) 再建プロジェクトの下、バイオミメティック足場の軟骨再生 (BIOCART)。
Human articular chondrocytes (Ach) | Lonza | CC-2550 | |
RAD16-I peptide solution (PuraMatrix) | Corning | 354250 | |
Sucrose (tissue culture grade) | Sigma | S0389 | |
Cell culture inserts (0.4 µm pore, 12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
Chondrocyte Basal Medium (CBM) | Lonza | CC-3217 | |
SingleQuots of Growth Supplements | Lonza | CC-4409 | |
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Lonza | DE14-801F | |
Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P) | Sigma | A8960 | |
Human transforming growth factor-β1 (TGF-β1) | Millipore | GF111 | |
RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Invitrogen | LC 2005 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
Anti-Actin | SCBT | sc-1615 | |
Anti-Collagen I | Abcam | ab138492 | |
Anti-Collagen II | Abcam | ab3092 | |
Anti-Collagen X | Abcam | ab182563 | |
Antigoat IgG-HRP | Abcam | ab97100 | |
Anti-mouse IgG-HRP | Abcam | ab97023 | |
Anti-rabbit IgG-HRP | Abcam | ab97051 |