Здесь мы представляем протокол для получения 3D-культура систем самостоятельного монтажа подмостей пептид содействовать дифференциации Дедифференцированная человека суставной хондроцитов в хрящевой ткани.
Описан полезным методом для культивирования клеток в самостоятельной сборки нановолокно трехмерные (3D) леску. Эта культура система воссоздает среду, которая тесно имитирует структурной особенности-поляризованных ткани. Кроме того особую внутреннюю нановолокно структура леса делает прозрачным для визуального света, который позволяет для легкой визуализации образца при микроскопии. Это преимущество во многом был использован для изучения миграции клеток, Организации, распространение и дифференциации и таким образом любое развитие их конкретной клеточной функции путем пятнать с конкретными красителей или зондов. Кроме того в этой работе, мы описываем хорошую производительность этой системы легко изучить redifferentiation расширенной человека суставной хондроцитов в хрящевой ткани. Клетки были инкапсулируются в самостоятельной сборки пептид подмостей и культивировали при определенных условиях для содействия chondrogenesis. Трехмерные культур показали хорошие жизнеспособность в течение 4 недель эксперимента. Как и ожидалось, образцы искусственного с хондрогенном индукторов (по сравнению с-индуцированной управления) окрашенных сильно положительный толуидиновый синий, (который пятна гликозаминогликанов (GAGs), которые весьма присутствуют в внеклеточного матрикса хряща) и выразили конкретные молекулярные маркеры, включая коллагена типа I, II и X, по данным западной помарке анализа. Этот протокол является простой для выполнения и может использоваться в исследовательских лабораториях, отраслей промышленности и для образовательных целей в лабораторных курсах.
На протяжении многих десятилетий культуры mammalian клетки выполнена в экспериментальных условиях, с использованием систем классический двухмерный (2D) культуры из-за практических и экономических проблем независимо от не физиологические аспекты. Хотя эта система культура помогает изучить и понять наиболее молекулярных и клеточных механизмов, мы знаем сегодня, что новые парадигмы культуры клеток необходимо изучить более сложные сотовых систем. Таким образом трехмерные (3D) культуры системы необходимо воссоздать микроокружения, биофизически, биомеханической и биологически более похож на что из натуральных тканей. В последние годы, 3D культуры системы, в целом, стали более распространенными среди исследователей и промышленности так, как они представляют новую модель исследования или скрининга в ячейки, которые могут расти в пространстве, создать к ячейке или взаимодействия клеток матрица, миграция и в конечном итоге дифференцироваться в конкретной ячейке линий.
Общая цель этой методологии должна воссоздать в vitro сотовой микроокружения, ближе к микроокружения в естественных условиях . В частности синтетические эшафот самостоятельной сборки пептида (ПСП) является типом биоматериала с уникальными свойствами; Он образует сеть нанометрового размера поры, сделанные из слабого взаимодействия среди пептидов с механическим и структурные свойства аналогичных те из природных внеклеточной матрицы. Другими словами, рациональность за использование этого материала, что он создает поистине 3D-среды, которая идеально подходит для получения псевдо 3D тканей или органа подразделения. Однако, самое главное, контекст 3D позволяет 3D структуры для получения новых биологических функций, которые обычно не присутствуют в 2D культуры платформы, такие как свойства, относящиеся к ткани архитектуры, явления массового переноса, клетки кучность и в конечном итоге Морфогенез ткани, которые являются ключевыми факторами в будущих исследований и развития функциональных тканей и органов1,2. Кроме того преимуществом ПСП над их естественными партнерами (коллаген, Matrigel) является, что они очень стабильны при комнатной температуре и не требуют особых условий для пост-производства, распределения и хранения3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. ПСП прост в обращении, когда это необходимо; 3D гели можно получить просто путем увеличения ионной силы или корректировка pH нейтралитета1,2. Наконец по методике, описанной здесь был широко используются в vitro содействовать обслуживания, роста и дифференцировки целого ряда типов клеток, в том числе хондроцитов, гепатоциты, эндотелиальные клетки, остеобласты, нейрональные клетки также как эмбриональные и соматических стволовых клеток3,4,5,6,,78,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. в настоящей работе, мы описывают использование 3D-культура системы различать человека расширение суставной хондроцитов (Хач) в хрящевой ткани как описано11.
Здесь описан метод в культуре клеток в 3D-системы с помощью ПСП. В этом синтетических биоматериала клетки сначала смешиваются с раствором пептид, который впоследствии наведено для самостоятельной сборки, создание сети нанометрических размеров вокруг клетки и поэтому создание действительно 3D окружающей среды (рис. 1). Важно учитывать, что сотовой поведение зависит от значения матрицы жесткости (т.е., распространение, миграции и дифференциации). Таким образом общие методологические управления заключается в культуре клеток на вершине пептида леску с теми же значениями жесткости (культура в двух измерениях).
Ранее наша группа и другие описали использование трехмерных (3D) культуры платформ с разнообразной клетки систем3,4,5,6,,78 ,9,10,11,12,13,14,15. В настоящей работе, мы опишем простой и надежный способ получения 3D культуры систем, которые применимы к любому типу клеток млекопитающих, включая любой тип функциональных клеток эмбриона или взрослых стволовых клеток, или в конечном итоге, неблагополучных клетки изолированы от биопсии или опухоли и т. д.. Кроме того самостоятельно, если стволовые клетки эмбриона или взрослый происхождения они бы лучше потенциала приверженность линии в 3D среде, чем в классической 2D культуры блюда10,11,12, 13,14,15. Таким образом культура клетки в этой системе приведет к дифференциации в функциональных тканей как структуры, которые могут быть использованы в различных приложениях, от репаративной или регенеративной биомедицины фармакологические и токсикологические платформ.
Мы показали ясно выигрыш в функции клеток, потому что сотовой микроокружения похож на что из натуральных тканей с точки зрения структуры matrix и биомеханических, биофизических и биологических параметров. Тем не менее как система становится более сложной, количество параметров, которые должны быть регулируется также увеличивается, которая включает в себя необходимость внешней поддержки платформы (например, активный перфузии системы, чтобы избежать переноса массы явлений связанных вопросов ). Трехмерно культивируемых клеток лучше с точки зрения регулирования основных мероприятий, например, миграция, пролиферации и дифференцировки. Они могут стать сложными сетями, позволяя расширение сотовый помех, который является на сегодняшний день является необходимым следствием роста и дифференциации в 3D. Тот факт, что соки можно создать условия в vitro похож на те представляет белков внеклеточного матрикса, является преимуществом, поскольку рациональное исследование эффекта производится для каждого компонента, добавлены к эшафоту (фактор роста, полисахарид или сигнализации пептид) может легко осуществляться.
Явные преимущества использования ПСП, по сравнению с другими природных лесов, такие как коллаген типа I и Matrigel, являются следующие: 1) ПСП является синтетическим биоматериала с минимальным отклонением от партии до серийного производства; 2) ПСП имеет способность функционализированных с конкретными пептид мотивами; и 3) ПСП представляет низкая способность к биологическому разложению в пробирке, которая разрешает сохранение 3D конструкции с же биофизические, биомеханика и структурные свойства с течением времени. Однако, ограничение использования соки по сравнению с другими леса находится на этапе инкапсуляции, где клетки находятся в враждебного окружения из-за низкого pH. Таким образом это важный шаг в описанных методологии. Кроме того важно установить концентрацию ПСП для каждого типа конкретной ячейки перед началом любого эксперимента. Это важно, на самом деле, когда клетки культивировали на или в эти биоматериалы, поскольку каждый тип ячейки будут представлены оптимальные биомеханические условия роста.
Наконец мы считаем, что дизайн и изготовление этого типа биоматериала эшафот повысит разработка моделей 3D ткани более физиологических и надежной для фармацевтической промышленности развивать лучше терапевтические подходы для Регенеративная медицина, рак или любого медицинского лечения.
The authors have nothing to disclose.
Исследования, проведенного авторами в части поддержали грантов от Европейского союза седьмой рамочной программы (FP7/2007-2013) под Грант соглашение № 229239 и от АО Фонд, разведочных исследовательских совместных исследований программы острый Хрящ травмы/поражения/дефекта (CRP ACI) в рамках проекта биоактивные и Biomimetic подмости для регенерации хряща (BIOCART).
Human articular chondrocytes (Ach) | Lonza | CC-2550 | |
RAD16-I peptide solution (PuraMatrix) | Corning | 354250 | |
Sucrose (tissue culture grade) | Sigma | S0389 | |
Cell culture inserts (0.4 µm pore, 12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
Chondrocyte Basal Medium (CBM) | Lonza | CC-3217 | |
SingleQuots of Growth Supplements | Lonza | CC-4409 | |
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Lonza | DE14-801F | |
Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P) | Sigma | A8960 | |
Human transforming growth factor-β1 (TGF-β1) | Millipore | GF111 | |
RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Invitrogen | LC 2005 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
Anti-Actin | SCBT | sc-1615 | |
Anti-Collagen I | Abcam | ab138492 | |
Anti-Collagen II | Abcam | ab3092 | |
Anti-Collagen X | Abcam | ab182563 | |
Antigoat IgG-HRP | Abcam | ab97100 | |
Anti-mouse IgG-HRP | Abcam | ab97023 | |
Anti-rabbit IgG-HRP | Abcam | ab97051 |