공부 Varicosity 형성 및 중앙 신경 축 삭에서 복구 하기 위한 Microbiomechanical 시스템
Summary
이 프로토콜 varicosities 뉴런에서의 빠르고 가역 유도 순수 관련, 압력 액체 접근 방식을 설명합니다.
Abstract
Axonal varicosities는이 성분의 높은 학위를 가진 축 삭의 샤프트 따라 확대 구조. 그들은 신경 퇴행 성 질병 또는 부상, 두뇌에 뿐만 아니라 정상적인 두뇌에서 존재 한다입니다. 여기, 빠르게, 안정적으로, 그리고 역 유도 axonal varicosities 새로 설립 micromechanical 시스템 varicosity 형성 및 이종 단백질 구성에 적용 하는 메커니즘을 이해 하 고 우리 수 있도록 설명 합니다. 이 시스템은 스트레칭의 효과에 주로 집중 하는 다른 체 외에 시스템에서 다른 뉴런의 다른 subcellular 구획에 압축 및 전단 스트레스의 효과 평가 하는 새로운 수단을 나타냅니다. 중요 한 것은, 우리의 시스템의 고유한 기능 때문에 우리는 최근 그 가압 유체 응용 프로그램 수 있습니다 신속 하 고 역 유도 axonal varicosities 일시적인 수용 체 잠재력 채널의 활성화를 통해 보여주는 새로운 발견을 했다. 우리의 biomechanical 시스템 마약 관류, 라이브 세포 이미징, 칼슘 이미징 및 패치 클램프 기록 함께 편리 하 게 이용하실 수 있습니다. 따라서,이 방법은 공부 mechanosensitive 이온 채널, axonal 수송, axonal 골격 역학, 칼슘 신호, 규정과 형태학 변화와 관련 된 외상 성 뇌 손상에 대 한 채택 될 수 있다.
Introduction
Varicosity 형성, 또는 붓기/구슬, 축 삭을 따라 neurodegeneration 많은 장애 또는 다 발성 경화 증, 알츠하이머병, 파 킨 슨 병를 포함 하 여 중앙 신경의 상해에서 관찰의 눈에 띄는 기능입니다 그리고 충격 뇌 부상1,2. 활동 전위 전파와 시 냅 스 전송3axonal varicosities의 중요 한 생리 적 영향에도 불구 하 고는 varicosities는 생성 하는 방법을 알 수 없는 남아 있습니다. 최근, 설치류에서 교양된 hippocampal 신경에 새로 설립 된 microbiomechanical 분석 결과 사용 하 여, 우리 기계적 자극에 매우 흥미로운 기능으로 이러한 뉴런 varicosities 일으킬 수 발견. 첫째, varicosity 유도 급속 하다 (< 10 s) 고이 프로세스는 예기치 않게 뒤집을 수. 둘째, varicosity 개시 압력 피 강도 따라 달라 집니다: 높은 압력, 빨리 개시. 셋째, varicosity 개시 신경 연령에 따라 달라 집니다. 젊은 신경의 축 삭 이전 뉴런의 그에 비해 기계적 스트레스에 더 반응이 나타납니다. 넷째, dendrites 이러한 뉴런의 초기 축 삭 세그먼트 동안 hippocampal 신경의 축 삭을 따라 varicosities 폼 같은 puffing 조건 변경을 표시 합니다. 따라서, 우리의 연구는 신경 극성의 새로운 기능을 공개 했다. 생체 외에서 시스템으로 이러한 결과 생리 적으로 관련. 우리 axonal varicosities 가까이 두개골 영향, 우리의 생체 외에서 일치 직후 쥐의 somatosensory 피 질에서 다중 초점 방식에서 개발 했다 온화한 외상 성 뇌 손상 (mTBI)에 대 한 vivo에서 모델을 사용 하 여, 결과4. 그것은 중요 한 우리의 얼룩 및 이미징 mTBI 쥐의 신경 형태학 변화의 스냅 샷 제공, vivo에서 수행 이후 기계적 영향 동안 신경 형태학의 시간 경과 이미징이 가능 하지.
이 액체 피 시스템 수 있었습니다 관련 기계적 스트레스 유발 varicosity 형성 된 독특한 기능을 잡으려고 뿐만 아니라 기본 메커니즘을 확인 하. 테스트 함으로써 다른 세포 외 솔루션, 차단제와 mechanosensitive 이온 채널, 세포 생리학의 다른 후보자의 오프너, 우리는 일시적인 수용 체 잠재력 양이온 채널 인도의 V 회원 4 (TRPV4) 확인 채널을 캘리포니아2 + 그리고 Na+ 에 침투성 피 활성화는 주로 axonal varicosity 형성4초기 기계적 스트레스를 감지 합니다. 이 추가 siRNA 녹아웃 방식으로 확인 되었다. 함께,이 새로운 분석 결과 시스템 hippocampal 신경 문화 개발 했습니다 찍은, 다른 기술을 조합에 특히 중앙 신경의 micromechanical 속성을 공부에 대 한 매우 귀중 한입니다.
우리는 설립이 micromechanical 시스템와 독특한 몇 가지 주요 측면에서 이전 기존 시스템에서 다릅니다. 첫째,이 시스템에는 신경 압축 및 전단의 형태로 비행기 밖으로 기계적 스트레스 경험. 기계적 충격, 동안 신경 프로세스 coverslip 표면에 부착 된 유지 하 고 이동 하지 않습니다. 이 다른 실험 주로 절곡 하 고 비행기에서 스트레칭 관련 시스템 (또는 긴장)와 다른, 예를 들어, 번들된 axons의 편향 같은 문자열5,6 이동 또는 micropatterned에 성장 축 삭 기지개 채널 고 stretchable 막7,8. 또한, 비록 axonal varicosities 또한에서 유도 될 수 있다 액체 피 시스템 이러한 설정 과정에서에서 같은이 분석 실험 (몇 시간6,,7810 분)에서 훨씬 더 많은 시간이 나타나고 돌이킬 수 없는. 마지막으로, 우리의 시스템 로컬 유체 피를 사용 하 여 수 varicosity 형성의 공간 기능 시험 (예., 모 수석, 모 수석 등뼈, 소마, axonal 초기 세그먼트, axonal 터미널), 그것의 일시적인 기능 외. 이 시스템을 사용 하 여, 우리는 여러 예상치 못한 독특한 기능과를 axonal varicosity 형성, 특히 급속 한 발병, 느린 가역 및 축 삭 모 수석 극성을 발견 했다.
우리가이 문서에서 설명 하는 시스템은 분자의 많은 기술과 호환 되 고 세포 생물학. 예를 들어, 신경 형태와 기능에 기계적 스트레스의 효과 연구, 그것은 함께 사용할 수 있습니다 myelin coculture, 형광 공명 에너지 전달 (무서 워) 및 총 내부 반사 형광 (TIRF), 이미징 시간 경과 칼슘 이미징, 그리고 패치 클램프 기록입니다. 이 문서에서 우리는 시스템의 핵심 구성 요소에 초점. Hippocampal 신경 문화, 액체 피 설정, axonal 전송에 대 한 고해상도 시간 경과 영상 및 칼슘 이미징 아래 단계별 설명 됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 microbiomechanical 분석 결과의 절차는 똑 바른 앞으로 이다. 그것은 그것의 모든 단계는 신중 하 게 실시 하는 경우 신뢰할 수 있는 결과 생산할 예정 이다. 잘못 수행 하는 경우 성공적인 데이터 수집을 방해 것입니다 하는 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 중요 한 단계 시작 상류 puffing 자극의 실제 응용 프로그램의. 조심 해 부, 경작, 및 관리의 기본 신경 문화는 답해야 합니다. 교양된 신경 건강 한…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
모든 동물 실험 지침에 따라 국립 연구소의 건강 동물 사용 실시 되었습니다. 이 작품은 C. 번에 건강의 국가 학회 (R01NS093073 및 R21AA024873)에서 교부 금에 의해 부분에서 지원 되었다.
Materials
| 12 mm coverslips | Warner Instruments | 64-0702 | for 24-well plate |
| 25 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | for 6-well plate |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Roche | 11 179 179 001 | |
| 10X PBS | National Diagnostics | CL-253 | |
| Na2SO4 | Fisher Scientific | S373-500 | |
| K2SO4 | Fisher Scientific | P304-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Protease enzyme | Sigma | P4032 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x (P/S) | Gibco | 15140122 | |
| MEM Earle's Salts | Gibco | 11090 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Arabinosylcytosine (Ara-C) | Sigma | 147-94-4 | |
| Opti-MEM media | Gibco | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1854313 | transfection reagent |
| Borosilicate rods | World Precision Instruments Inc. | PG52151-4 | for puffing pipette |
| rubber tubing | Fisher Scientific | 14-169-1A | |
| 10cc plastic syringe and plunger | Becton Dickinson | ||
| micromanipulator | Sutter Instruments | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-3 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C70-500 | |
| Cell culture dish (35 mm x 10 mm) | Corning | 3294 | |
| Fluo-4 AM | Molecular Probes | F14201 | for calcium imaging |
| Mito-YFP construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| YFP-N1 construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Eclipse TE2000-U Mcroscope | Nikon | ||
| Plan Fluor ELWD 20x lens | Nikon | 062933 | objective |
| Apo TIRF 100x/1.49 oil lens | Nikon | MRD01991 | objective |
References
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