Summary

Zwei-Photon intravitalen Bildgebung der Leukozyten im Rahmen der Immunantwort in Lipopolysaccharid behandelt Maus Leber

Published: February 06, 2018
doi:

Summary

Wir haben eine neuartige chirurgische Protokoll für die zwei-Photonen-Bildgebung live Mäuse Leber mit minimaler Invasion. Mit dieser Technik haben wir die detaillierte Struktur der Leber während Lipopolysaccharid-induzierte Endotoxämie identifiziert. Wir erwarten, dass diese Methode verwendet werden, kann um die Wirksamkeit der verschiedenen Reagenzien Behandlung zur hepatischen Leukozyte Migration zu bestimmen.

Abstract

Sepsis ist eine schwere Infektion, die Organversagen und Gewebe verursachen kann Schaden. Obwohl die Mortalität und Morbidität Preise im Zusammenhang mit Sepsis sind extrem hoch, keine direkte Behandlung oder im Zusammenhang mit der Orgel Mechanismus wurde ausführlich in Echtzeit geprüft. Die Leber ist das zentrale Organ, das Gifte und Infektionen im menschlichen Körper steuert. Hier wollten wir intravitalen Bildgebung der Maus Leber nach Induktion der Endotoxämie durchführen, um die Beweglichkeit der Immunzellen, wie Neutrophilen und Leber Kapsel Makrophagen (LCMs) verfolgen. Dementsprechend haben wir eine neuartige Operationsmethode für die Exposition der Leber mit minimal-invasiven Chirurgie entwickelt. Mäuse wurden mit Lipopolysaccharid (LPS), eine gemeinsame Endotoxin intraperitoneal injiziert. Mit unserer neuen chirurgischen Ansatz für Belichtung und intravitalen Bildgebung der Leber, wir fanden, dass die Neutrophilen Maus Rekrutierung in LPS behandelten LysM-grün fluoreszierenden Proteins (GFP) wurde Maus Leber erhöht im Vergleich mit dem in Phosphat-gepuffert Leber mit Kochsalzlösung behandelt. Nach LPS-Behandlung stieg die Zahl der Neutrophilen deutlich mit der Zeit. Darüber hinaus visualisiert mit Hilfe von CX3Cr1-GFP-Mäusen, wir erfolgreich Leber residente Makrophagen genannt LCMs. Daher kann um die Wirksamkeit der neuen Reagenzien zur Steuerung immun Mobilität in Vivozu untersuchen, Bestimmung der Motilität und Morphologie der Neutrophilen und LCMs in der Leber wir therapeutische Wirkung im Organ Versagen und Gewebe Schäden durch identifizieren können Leukozyten-Aktivierung bei Sepsis.

Introduction

Die Leber ist der großen Stoffwechselorgan bei Säugetieren; Es fungiert als ein Kontrollturm für Energie, Hormone und Entgiftung1. Aufgrund seiner Bedeutung haben Forscher um die Veränderungen in der Leber während einer Entzündung zu erhellen viele in Vitro und in Vivo Experimente durchgeführt. Intravitalen Mikroskopie wurde verwendet, um live-Bilder aus der Leber2 zu erfassen. In der Tat führte verschiedene Leber bildgebende Verfahren wurden2,3,4,5,6. Jedoch um einen vereinfachten chirurgischen Ansatz entwickeln und Stabilisierung der das Zielorgan und die Immunzellen, gestalteten wir ein einfaches Protokoll, das Forscher um minimieren Sie ihren Aufwand für die intravitalen Bildgebung führen können.

In dieser Studie führten wir eine stabile und neuartige bildgebende Kammer und chirurgische Technik, die verwendet werden könnte, um Blutungen und mögliche Infektionen zu minimieren. Wir bestätigen, dass die Leber für mehr als 2 h intakt geblieben. Mit dieser Methode haben wir erfolgreich Morphologien LCMs7 und Neutrophilen unter septischen Zustand identifiziert. Da diese Methode physikalische und biologische Störfaktoren wie Zittern und unerwartete Entzündung während chirurgischen Eingriffs minimiert wird, erwarten wir, dass diese Methode verwendet werden könnte, um akute Reaktionen der immunen Zellen in der Leber als Reaktion auf zu beobachten Reagenzien wie LPS.

Protocol

Alle Verfahren wurden gemäß den Richtlinien des institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der Yonsei University College of Medicine, Korea durchgeführt. LysM-grün fluoreszierenden Proteins (GFP; Gfp / +) Mäuse8 und CX3Cr1-GLP (GLP / +)9 Mäuse im Alter von 8 bis 12 Wochen für intravitalen Bildgebung verwendet wurden. Alle chirurgischen Instrumente wurden autoklaviert und mit 70 % Alkohol desinfiziert. (1) speziell angefertigte Maus …

Representative Results

Eine einfache und sehr stabile bildgebende Kammer wurde entwickelt. Der Boden der Kammer wurde mit Silikon, die verhindert Verrutschen der Maus Körper und Organe abgedeckt. Zusätzlich, da Silizium die richtige Menge an Elastizität aufweist, könnte dies induziert durch den Druck der Abdeckung Folie (Abbildung 1A, C) zu erwartenden Schaden verhindern. Zweite, Gewebe-Safe Kleber (Vet-Anleihe) wurde angewandt, um die extrahierten Leber auf de…

Discussion

Die Leber wurde aktiv von vielen Gruppen3,10, aufgrund der Bedeutung ihrer Funktion untersucht. Zum Beispiel schlug Heymann Et Al. eine empfindliche Methode mit Agarose. Obwohl diese Methode erwies sich hochpräzise, dauert die Agarose-Einstellung. Jedoch konnte alle Verfahren mit unserer Methodik innerhalb von 30 min, andere Störfaktoren zu minimieren durchgeführt. Zweitens ist die Stabilisierung der Leberzellkrebs äußerst wichtig, weil der Herzschlag der Vi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der National Research Foundation von Korea (NRF) gefördert durch die Regierung von Korea (MSIP, Grant Nr. 2016R1A2B4008199 Y-m. (H.), Ministerium für Gesundheit und Wohlfahrt, Republik Korea (gewähren Nummer: HI14C1324).

Materials

Custom designed chamber Live Cell Instruments Custom-designed size
Metal cover slide Live Cell Instruments Custom-designed size
Cover glass Electron Microscopy Sciences #72204-03
Sylgard 184 Silicone elastomer kit Dow Corning
Erlenmeyer flask DURAN 21 216 36
Cell culture plate (Flat type) HYUNDAI Micro Co. H31006
Desiccator ADARSH 55204
High Q BOND SE 5 mL BJM LAB To make semi-permanent dam
Flexible Silicone Rubber Heaters Omega SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800
DC power supply Toyotech DP30-03A
Phosphate-buffered saline Home-made
Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis Sigma-Aldrich L6011
Texas Red Dextran Thermo Fisher Scientific D1830
15 mL High-clarity polypropylene
conical tube
FALCON 14-959-49B
0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) Sartorius 16555k
1.5ml Micro Tube, Amber Axygen MCT-150-X For light-blocking
1 mL syringe Korea Vaccine KV-S01
3 mL syringe Korea Vaccine KV-S03
10 mL syringe Korea Vaccine KV-S10
0.3 mL insulin syringe Becton Dickinson 324900
Hair removal cream 100 mL Body natur
Cotton swab ABDI
Zoletil 50 5 mL Virbac
Rompun 10 mL Bayer
Heating plate Live Cell Instruments PH-S-10 Custom-designed size
DC controller Live Cell Instruments CU-301
Microdessection Scissors Harvard Apparatus 72-5418
Scissors Roboz RS-5882
Forceps Roboz RS-5137
Vet bond 3M 1469SB
ZEN software (Black Edition) Carl Zeiss Program for LSM 7 MP
LSM 7 MP Carl Zeiss
Volocity PerkinElmer Analysis program

References

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Cite This Article
Park, S. A., Choe, Y. H., Lee, S. H., Hyun, Y. Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver. J. Vis. Exp. (132), e57191, doi:10.3791/57191 (2018).

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