Trombocyttal lagerstyring baseret på screening microparticle indhold i trombocyttal koncentrater er en ny kvalitet forbedring initiativ i hospitalers blodbanker. Målet er at differentiere aktiveret fra ikke-aktiveret blodplader til at optimere brugen af blodplader. At yde ikke-aktiveret blodplader til hæmatologi-onkologi patienter kan reducere deres høje risiko bliver ildfaste.
Trombocyttal lagerstyring baseret på screening microparticle indhold i trombocyttal koncentrater er en ny kvalitet forbedring initiativ for hospitalers blodbanker. Celler fragment fra mikropartikler (MP) når de er stressede. Blod og blodkomponenter kan indeholde cellulære fragmenter fra en bred vifte af celler, især fra aktiveret blodplader. Når du udfører deres roller som medfødte immun celler og store aktører i koagulation og hæmostase, blodplader Skift figur og generere mikropartikler. Med dynamisk lysspredning (DLS)-baseret microparticle opdagelse, er det muligt at differentiere aktiveret (høj microparticle) fra ikke-aktiveret (lavt microparticle) blodplader i transfusioner, og optimere anvendelsen af dette knappe blodprodukt. Tidligere forskning tyder på, at give ikke-aktiveret blodplader til profylaktisk brug i hæmatologi-onkologi patienter kunne reducere deres risiko for at blive ildfaste og forbedre patientplejen. Målet med denne screeningsmetode er at rutinemæssigt differentiere aktiveret fra ikke-aktiveret blodplader. Metoden beskrevet her skitserer trinene der skal udføres rutinemæssig trombocyt lagerstyring i en blodbank: at opnå en stikprøve fra en trombocyt transfusion, Ilægning af prøven i kapillær DLS måling, udfører DLS test til identificere mikropartikler, og ved hjælp af den rapporterede microparticle indhold til at identificere aktiveret blodplader.
Interessen for mikropartikler har drejet sig hovedsagelig om deres deltagelse i celle til celle kommunikation og biologiske processer. 1 , 2 , 3 for nylig, mikropartikler har også tiltrukket interesse som potentielle tidlig diagnostisk markører af autoimmune og hjerte-kar-sygdomme. 4 , 5 mikropartikler, også kendt som ekstracellulære blærer eller exosomes, har været bredt undersøges ved flowcytometri. Desværre, på trods af bestræbelserne på at standardisere konventionel flow flowcytometri protokoller der er ikke enighed om den optimale protokol til brug. 6 , 7 , 8 , 9 , 10
Selv om konventionelle flowcytometri kan karakterisere specifikke MP delpopulationer, rapporterede11 det har flere begrænsninger. 11 , 12 , 13 , 14 nogle af disse begrænsninger er blevet behandlet ved hjælp af højere magt lasere og detektorer i en såkaldt “små partikler option”,15,16 samt påvisning på 15-25 ° fremad scatter vinkel og modificeret kappe pres . 17 , 18 alligevel, en hurtig og nem at bruge screeningsmetode, der kan kombineres med disse sofistikerede metoder er stadig nødvendig for at udnytte mikropartikler som tidlig diagnostisk markører. Forhøjede niveauer af mikropartikler er påviselige i omkring en tredjedel af normal blod donorer19 og kan indikere subklinisk betingelser. Høje microparticle niveauer i donorblod produkter kan derfor uforenelig med sårbare modtagere. 20
Når de leverer trombocyt transfusioner, er der en risiko for ikke-immune refraktion – en tilstand, hvori en patients krop afviser fortløbende transfusioner og tillader ikke, at en betydelig del af blodplader til at cirkulere. 21 , 22 ikke-immune refraktion kan resultere i spildt transfusioner, sundhedsmæssige komplikationer for patienter og udvidede hospital stays. 23 trombocyt transfusioner med høje numre af mikropartikler kan være en medvirkende faktor for udviklingen af ikke-immune refraktion i sårbare hæmatologi-onkologi patienter. 20 det er muligt at administrere trombocyt lager Ifølge sammensætningen af trombocyt transfusioner ved screening for mikropartikler dermed mindske risikoen for sårbare patienter. Men de fleste microparticle tests kræver isolering af mikropartikler fra blodplader5,12 eller er ellers meget labor intensivt24,25 , og kan derfor ikke gennemføres rutinemæssigt på hospitalet blodbanker.
Den teknik beskrevet bruger her dynamisk lysspredning (DLS) – også kendt som photon korrelation spektroskopi eller kvasi elastisk lysspredning. I årtier, har dynamisk lysspredning været flittigt brugt i den farmaceutiske industri til at karakterisere liposomal narkotika formuleringer eller emulsioner hvor partikelstørrelser er i rækken sub micron. 26 , 27 imidlertid værktøjer udviklet til disse programmer er ikke optimeret til skærmen blodprodukter. En ny DLS system blev udviklet for at overvinde de tekniske begrænsninger og skabe dynamiske lys spredning nyttig for screening af trombocyt transfusioner. 28
Dynamisk lysspredning målingerne udføres af lysende de suspenderede partikler med laserlys og analyserer tid variationen af spredte lysintensiteten, som er en konsekvens af partikler i suspension. Yderligere, denne metode bruger inverse forholdet mellem partikel hastighed og størrelse – små partikler gå hurtigt og store partikler bevæger sig langsomt – at give oplysninger om størrelse distributioner og relative koncentrationer af prøven komponenter. Ved hjælp af DLS, den gennemsnitlige microparticle kan indhold og gennemsnitlige radius af komponenten microparticle kvantificeres. Indhold af mikropartikler i blodprodukt er givet som % MP baseret på området i den målte histogram for partikel radier fra 50-550 nm. Mens partikler med radier under 50 nm registreres af DLS og rapporteret af DLS system, de ikke indgår i % MP. I stedet for at isolere mikropartikler fra blodplader, bestemmes heterogenitet af trombocyt transfusioner baseret på den relative indhold af mikropartikler og blodplader i en prøve. I virkeligheden, kan forholdet mellem trombocyttal og microparticle toppene bruges til at beregne den absolutte MP koncentration når trombocyttallet er kendt. 19
DLS giver sundhedspersonale med kvalitative og kvantitative oplysninger om mikropartikler fundet i prøver fremstillet af humant blod eller blodprodukter. Den største fordel ved den beskrevne DLS teknik over alternative teknikker såsom flowcytometri, elektronmikroskopi,29 nanopartikel tracking analyse30 eller afstemmelige resistive puls sensing31 er prøveforberedelsen: delprøver af trombocyt koncentrater kan måles direkte uden at skulle isolere MP fra blodplader, prøveopløsning eller andre ændringer. 9 , 17 endvidere DLS er en absolut dimensionering metode og lider ikke af manglen på kalibrering perler med passende brydningsindeks. 14 , 32
En sammenhæng mellem trombocyt aktivering og MP indhold har tidligere vist ved mikroskopi33,20 og kan udledes af stigningen i MP indhold i patologiske tilstande15,34, 35 , 36 og betingelser in vitro- kendt for at aktivere blodplader. 19 , 37 , 38 dog yderligere undersøgelser er nødvendige for fuldt ud at forstå forholdet mellem DLS-målt microparticle indhold og trombocyt aktivering. Baseret på vores nuværende viden, aktiveres blodpladerne indeholder høje numre af mikropartikler, de er bedst anvendes til terapeutisk behandling af aktivt blødning patienter39, mens hæmatologi-onkologi patienter drage fordel af ikke-aktiveret blodplader med ingen eller lavt indhold af mikropartikler20. Det er for nylig blevet rapporteret, at in vitro- lydhørhed af donor blodplader ikke markant indvirkning, recovery og overlevelse af disse blodplader i enkelt transfusioner til stabile, for det meste ikke blødning hæmatologi-onkologi patienter40 . Af denne konstatering, kan det konkluderes, at trombocyt aktivering identificeret ved høj MP indhold også spiller nogen væsentlig rolle i den forebyggende behandling af patienter. Men på grund af den smalle udvalg af patienter, denne undersøgelse ikke adresse donor faktorers indvirkning for komplekse patienter, der er febril (udelukket fra undersøgelsen), ikke stabil og modtager mange mere end bare et trombocyttal transfusion. Spørgsmålet hvordan kompleksiteten af disse patienters tilfælde kan reduceres – som holder løftet om at reducere refraktion – forbliver ubesvaret.
Mikropartikler er tidlige markører for inflammation41,42,43,44 og trombocyt aktivering45 og opdages derfor i mange normale donorer. 19 derfor, aktiveres blodpladerne og mikropartikler er til stede i trombocyttal donationer. Det er rimeligt at hypotesen om, at patienter med feber, dvs, en fuldt aktiveret medfødte immunsystem, ikke kan tåle den ekstra udfordring af en transfusion af aktiverede blodplader. Men undersøgelser er nødvendige for at bevise denne hypotese. Microparticle screening kan afhjælpe den nuværende usikkerhed om indholdet af trombocyt transfusioner og reducere kompleksiteten af patientbehandlingen.
Forholdet mellem aktiveret til ikke-aktiveret blodplader i en blodbank afhænger først og fremmest befolkningens donor og i langt mindre grad om transport, bestråling, patogen inaktivering og andre processer, der kan øge trombocyt aktivering i koncentrater. 19 data fra store hospitalers blodbanker i USA viste, at den gennemsnitlige sammensætning af trombocyt lager er 49% aktiveret og 51% ingen-aktiveret (interval for aktiverede blodplader: 38-62%, personlig kommunikation). Hvis blod produkt udbydere eller hospitalsblodbanker ønsker at vide, hvor mange aktiveret og ikke-aktiveret trombocyt koncentrater, de producerer eller modtager, og ønsker at styre deres beholdning baseret på trombocyt aktivering som anført af microparticle indhold, dette protokollen kan være relevant for dem.
Baseret på trombocyt sammensætning en blodbank vil være i stand til direkte ikke-aktiveret, homogen blodplader for profylaktisk brug og aktiveret, heterogene blodplader til terapeutisk brug. Trombocyttal screening gør det muligt hospitaler til at maksimere brugen af den tilgængelige lagerbeholdning, som forbedrer patientpleje og nedsætter omkostningerne. Denne protokol er beregnet til laboratoriepersonale, der er bekendt med grundlæggende håndtering og manipulation af blodprodukter.
Præsenteres her er en screeningsmetode for mikropartikler i trombocyttal transfusioner, der rutinemæssigt kan anvendes til at administrere hospital blodbank lager hvor at vælge produkt baseret på microparticle indhold er ønskeligt. Formålet med denne protokol er at skitsere gennemførelsen og evalueringen af DLS for screening af donerede blodplader. Den beskrevne protokol adresser de almindelige spørgsmål af non-invasiv adgang til prøver, integration af test i blodbank arbejdsflow og præstationsegenskaber.
Denne protokol beskriver en dynamisk lysspredning metode for microparticle screening optimeret til høj partikel koncentrationerne fundet i biologiske prøver såsom trombocyt koncentrater. Metoden for DLS er i sagens natur standardiseret til nøjagtigt for at måle størrelsen. Den relative koncentration af mikropartikler kan omdannes til en absolut koncentration, hvis trombocyttal koncentration er kendt og trombocyttal topareal anvendes som reference peak19. Som trombocyt koncentrationer fremstilles normalt med hæmatologi analysatorer eller flow cytometers disse metoder kan betragtes som følgesvend teknologier til DLS.
Funktionaliteten af DLS system er forsikret ved at køre kontrol perler regelmæssigt. Destilleret vand kan måles for at kontrollere at baggrundsstøj er minimal. Kommercielt tilgængelige trombocyt standarder kan analyseres som MP-negative kontroller og efter tilsætning af 125 nm radius perler, som MP-positive kontrol. Inden for de biologiske vifte af MP koncentrationer af interesse er procedurerne, der praktisk og hurtig til at udføre som en del af blod bank rutinen.
I modsætning til flowcytometri, er denne metode ikke baseret på sammenligne spredning intensiteter af partikler, men snarere hastigheden af deres Brownske bevægelser. Således, exosomes kan også påvises trods deres lille størrelse og er rapporteret særskilt fra MP.
Udformet som en screeningsværktøj, er begrænsninger af denne metode relateret til dets manglende evne til at skelne mellem forskellige typer af mikropartikler. Der er potentielle plads til forbedring, hvis yderligere isolation trin bruges; prøver kan blive testet før og efter de særlige fjernelse af mikropartikler gennem antistof kombineret magnetisk bead capture. Derudover kan det antages, at alle detekterede mikropartikler er celle afledte fordi Chylomichroner dannet i hyperlipidæmi47,48 og små bakterier eller vira6 vil også blive rapporteret i rækken microparticle. Men andre garantier eksisterer inden for blodforsyningen til undgå stærkt lipemic eller forurenede blodplader til at indtaste den hospital blodbank.
Valget af antikoagulans i stikprøven påvirker omfanget af trombocyt aktivering og derfor MP indhold49. Denne faktor skal anses for sammenligninger af forskellige produkter. Desuden udveksling af plasma med MP gratis suspension medier såsom PAS vil påvirke MP indhold og tærsklen for bestemmelse af heterogenitet-hvis kun omkring en tredjedel af den oprindelige MP indhold er tilbage inden for den resterende plasma i koncentrat en Derfor vil lavere MP indhold tærskel angive det samme niveau af trombocyt aktivering som 100% plasma. Procent MP er MP indhold i forhold til blodplader. Tidligere forlød det, at den gennemsnitlige trombocyttallet PAS produkt var lavere, så den gennemsnitlige % MP stadig var 9,5%19. % MP tærsklen for PAS blodplader licenseret i USA er i øjeblikket angivet til 10%.
Mens den primære kilde til MP i trombocyttal koncentrater er donor, processer, der forårsager stress til blodplader vil øge MP niveau afhængigt af modtagelighed af blodplader til at understrege-hvis blodplader er allerede stærkt aktiveret, mindre stressfaktorer såsom forlænget holdbarhed, patogen inaktivering, vask, kan bestråling eller transport over lange afstande føre til betydelige stigning i MP indhold. Ingen af disse stressfaktorer har vist sig at påvirke homogen, ikke-aktiveret blodplader19. Derudover bør opmærksomhed være opmærksom på mulighederne for ændringer i prøven sammensætning inden for kapillær hvis ikke testet umiddelbart efter fremstillingen (afslutning af trin 3 i denne protokol).
Denne protokol fokuserer på bestemmelse af partikler til stede i trombocyttal transfusioner og bruge mikropartikler som biomarkører for trombocyt aktivering sammensætning. Trombocyttal transfusioner er markeret som enten ingen-aktiveret (orange) eller aktiveret (pink) baseret på en microparticle procent tærskel på 15%. Tærsklen på 15% MP for blodplader i 100% plasma var empirisk bestemt som gennemsnit 66th percentil fra flere steder.
Formålet med trombocyt lagerstyring baseret på rutinemæssig microparticle screening med DLS er at forbedre patienternes pleje og drev omkostningsbesparelser ved at forhindre ikke-immune trombocyt refraktion. Gennemførelsen af DLS system for screening af trombocyt poser vil muliggøre bruger hen til direkte ikke-aktiveret blodplader til patientgrupper mest udsatte for at udvikle trombocyt refraktion.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker af bloddonorer og personale på canadiske blod Services Network Center for anvendt udvikling for indsamling og produktion af trombocyt-enheder, der anvendes i denne undersøgelse. Vi anerkender Canada Foundation for Innovation og Michael Smith Foundation for sundhedsforskning infrastruktur-midler på UBC centrum blod forskning. Finansiering af offentliggørelse blev leveret af LightIntegra Technology Inc., producenten af ThromboLUX.
ThromboLUX-M | LightIntegra Technology Inc. | LPN120 | DLS System |
ThromboSight Software | LightIntegra Technology Inc. | LPN124 | DLS analysis software |
Capillaries | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Optinova MLE) | LPN065 | Custom extruded non-activating, non-birefringent plastic tube, inspected and irradiated |
MiniPet | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor TriContinent Scientific) | LPN082 | 100 µL fixed volume pipette for sampling |
MicroFlex 1-200 µL Pipette tips | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor ESBE Scientific) | LPN080 | Pipette tips for sampling |
Critoseal | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Fisher Scientific) | LPN075 | Capillary Tube Sealant |
Dukal Alcohol Pad or equivalent | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Dukal Corp.) | LPN085 | Isopropyl pad (saturated with 70% isopropyl alcohol) |
Control beads, 50 nm radius | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor PolySciences Inc.) | LPN128 | Control beads |
Microbead NIST Traceable Particle Size Standard, 3 µm | PolySciences Inc. | 64060 | Standard microbeads: 1.5 µm radius Polystyrene beads; range 1.43-1.58 µm; 1% solids suspensions in de-ionized water |
Nanobead NIST Traceable Particle Size Standard, 250 nm | PolySciences Inc. | 64014-15 | Standard nanobeads: 125 nm radius Polystyrene beads; range 120 – 130 nm; 1% solids suspensions in de-ionized water |
Genesis BPS RapidSeal II or equivalent | Genesis BPS | 428-SE640 | Tube sealer |
Fresenius Kabi Tube Stripper or equivalent | Fresenius Kabi | 6R4452 | Manual tube stripper |
Biohazard Shield – Cell Counter or equivalent | CardinalHealth | S1389-75 | Splash Shield |
Corning LSE Vortex Mixer or equivalent | Corning Incorporated | 6775 | Vortex mixer |
FACSCanto II Flow cytometer with FACSDiva software version 6.1.3 or equivalent | BD Biosciences | 338960 | Flow cytometer |