Summary

Обработка и лечение мужского европейских угорь (Ангилья Ангилья) для гормонального созревания и криоконсервации спермы

Published: January 28, 2018
doi:

Summary

Протоколы для созревания и спермы криоконсервация угорь улучшились за последние годы. Эта статья описывает наилучший протокол с помощью хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) для стимулирования созревания и метанола как криопротектора.

Abstract

В последние годы работали несколько исследовательских групп по разработке и совершенствованию новых протоколов для обработки угорь и созревания. Тем не менее, по состоянию на еженедельных инъекций хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) оказались вызревают мужчины после всего 5-6 недель лечения, производить большие объемы высокого качества спермы в течение нескольких недель. Кроме того, протоколы криоконсервирования спермы, используя различные наполнители, криопротекторов и охлаждения и оттаивания раз были ранее описаны для угорь. Здесь мы покажем, что Tanaka´s расширитель решение может непосредственно использоваться для оплодотворения или для криоконсервирования, что делает ненужным использование различных типов решений и разведения. Кроме того использование метанола как криопротектора делает этот протокол проста в использовании, как метанол имеет низкую токсичность и не активировать сперму. Спермы не нужно быть криоконсервированных сразу же после добавления криопротектора, и он может использоваться после будучи размороженным. Кроме того сперматозоидов по-прежнему высока после оттаивания, хотя это меньше, чем в свежей спермы. Цель этой работы заключается в том, чтобы показать лучшие доступные протокол для угорь обработку, созревания и криоконсервации спермы.

Introduction

За последние 25 лет количество европейских угорь (Ангилья Ангилья), прибывающие на европейском побережье неуклонно сократились на 90% 1,2,3. Существует несколько факторов, которые объясняют это резкое падение включая загрязнение, инфекции, перелова и Хабитат разрушения. Все это имеет огромное влияние на этот вид, приводит к включению угорь на Международного союза охраны природы (МСОП) списка как критические опасности 4. Следовательно необходимы развитие методов и протоколов для размножения в неволе.

Созревания угорь в плену достигается гормональное лечение 5,6,7 , но производство гамет у обоих полов очень сложно синхронизировать 8. Даже несмотря на то, что показал, что развитие новых имплантатов андрогенов ускорить женских угрей 9,10, сроков окончательного созревания самок по-прежнему высоко переменная и трудно контролировать 11. Таким образом кратковременного хранения спермы 12,13,14 и криоконсервацию методы необходимы для воспроизводства управления, что делает гамет синхронизацию ненужных 8.

Криоконсервация спермы угорь был разработан с 2003 года 15,16. Несколько исследователей разработан успешных протоколы, используя диметилсульфоксида (ДМСО) или метанола как криопротекторы 16,,1718,19,20. Хотя оба протокола были успешно использованы, полученные клетки жизнеспособность талой сперму замораживают с ДМСО ниже, чем с метанолом в 20,21. Кроме того угорь спермы активируется на контакт с ДМСО и требует более утомительным спермы манипуляции 19, поэтому метанола является более подходящим криопротектора для спермы угорь чем ДМСО.

Здесь протокол для оптимальной обработки и гормонального лечения угорь будут описаны ниже. Помимо этого лучший европейский угорь спермы криоконсервация протокол с использованием метанола как криопротектора и протокол для оценки качества спермы в этот вид также будет описано.

Protocol

Все процедуры для работы с угорь, указанных в настоящем протоколе были одобрены Комитет этики животных экспериментов на университетской политехнического де Валенсия, после испанского законы и правила, регулирующие эксперименты и процедуры на живых животных. 1. рыба техн?…

Representative Results

Сперма из 18 угрей с сперматозоидов, 70% или выше, был выбран для этого исследования. Результаты показали сокращение всех параметров качества после оттаивания по сравнению с теми из свежей спермы (таблицы 1 и 2). Результаты подвижности (средний ± S.E…

Discussion

Этот протокол описывает полный процесс созревания, обработку и спермы криоконсервация угорь. Описанные здесь условия животноводства являются оптимальными для быстрого созревания и производства больших объемов спермы высокого качества в этом видов 6,7<s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта публикация была финансируется Европейского союза Horizon 2020 исследований и инновационной программы под Марии Склодовской-Кюри грантовое соглашение не 642893 (Импрес), Канцелярия стоимость (стоимость действий FA 1205, AQUAGAMETE) и центр передовых научных исследований- 1476-4/2016/FEKUT.

Materials

AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 AQUACEN 3394ESP Benzocaine
NaCl Avantor  3624-19
Syringe BD Plastipak 305501 Syringe 1 mL
FC500 Beckman Coulter Flow cytometer
Air pump 100 EHEIM 4011708370032 Modified for suction
Eppendorf 1.5 Eppendorf 175508 Plastic tubes 1.5 mL
Falcon tubes Falcon 175747 Plastic tubes 15 mL
Flexible bucket Fiel 1040101 40 L, Black color.
Ethanol Guinama SL Mg96270
Cyopreservation straws  IMV Technologies 14550 500 µL straws
Live/Dead Sperm Viability Kit Invitrogen L7011 Cytometer Kit
Modelling clay JOVI Art 30 4 different colors
Precision scale PCB KERN & Sohn GmbH PCB35002 Digital scale
Saline solution Vitulia 0.9% Laboratorios Ern, S.A. C.N. 999790.8 Saline solution
Forceps Levantina de Lab. SL 3710025 30 cm metal forceps
Scissors Levantina de Lab. SL 3700014 Scissors 14cm
Ovitrelle (r-hCG) Merck SL EMEA/H/C/000320 Human chorionic gonadotropin
Nikon Eclipse 80i Nikon Microscope
CaCl2 Panreac Quimica SAU 2112211210
Na2SO4 Panreac Quimica SAU 3257091611
NaHCO3 Panreac Quimica SAU 1416381210
782M Camera Proiser 782M Camera for CASA
ISAS v1 Proiser ISAS v1 CASA software
SpermTrack-10 Proiser SpermTrack-10 Countig chamber for CASA
Beaker Pyrex 3L PYREX 2110668 Glass beaker 3L
Flask Pyrex 250 GL-45 PYREX 21801365 Glass flask 250 mL
KCl Scharlab SL PO02000500
Methanol Scharlab SL ME03061000
MgCl2 Scharlab SL MA00370500
BSA Sigma Aldrich 05482 Bovine serum albumina
Styrofoam box 34x34x30 cm and 5cm thick

References

  1. ICES_Working_Group_on_Eels. . Report of the 2011 Session of the Joint EIFAAC/ICES Working Group on Eels. , 246 (2011).
  2. Moriarty, C. European Catches of Elver of 1928-1988. Int. Rev. Hydrobiol. 75 (6), 701-706 (1990).
  3. Dekker, W. The fractal geometry of the European eel stock. ICES J. Mar. Sci. 57 (1), 109-121 (2000).
  4. Jacoby, D., Gollock, M. . Anguilla anguilla. The IUCN red list of threatened species. Version 2014.2. , (2014).
  5. Asturiano, J. F., et al. Effects of hCG as spermiation inducer on European eel semen quality. Theriogenology. 66 (4), 1012-1020 (2006).
  6. Pérez, L., et al. Induction of maturation and spermiation in the male European eel: assessment of sperm quality throughout treatment. J. Fish Biol. 57 (6), 1488-1504 (2000).
  7. Gallego, V., et al. Study of the effects of thermal regime and alternative hormonal treatments on the reproductive performance of European eel males (Anguilla anguilla) during induced sexual maturation. Aquaculture. 354, 7-16 (2012).
  8. Asturiano, J. F., Sørensen, S. R., Pérez, L., Lauesen, P., Tomkiewicz, J. First Production of Larvae Using Cryopreserved Sperm: Effects of Preservation Temperature and Cryopreservation on European Eel Sperm Fertilization Capacity. Reprod. Domestic Anim. 51 (4), 485-491 (2016).
  9. Di Biase, A., et al. Co-treatment with androgens during artificial induction of maturation in female eel, Anguilla anguilla: Effects on egg production and early development. Aquaculture. 479, 508-515 (2017).
  10. Lokman, P., Wylie, M. J., Downes, M., Di Biase, A., Damsteegt, E. L. Artificial induction of maturation in female silver eels, Anguilla australis: The benefits of androgen pre-treatment. Aquaculture. 437, 111-119 (2015).
  11. Mylonas, C. C., Duncan, N. J., Asturiano, J. F. Hormonal manipulations for the enhancement of sperm production in cultured fish and evaluation of sperm quality. Aquaculture. , (2016).
  12. Ohta, H., Izawa, T. Diluent for cool storage of the Japanese eel (Anguilla japonica) spermatozoa. Aquaculture. 142 (1-2), 107-118 (1996).
  13. Peñaranda, D. S., et al. European Eel Sperm Diluent for Short-term Storage. Reprod. Domestic Anim. 45 (3), 407-415 (2010).
  14. Ohta, H., Kagawa, H., Tanaka, H., Unuma, T. Control by the environmental concentration of ions of the potential for motility in Japanese eel spermatozoa. Aquaculture. 198 (3), 339-351 (2001).
  15. Asturiano, J., et al. Media and methods for the cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm. Fish Physiol. Biochem. 28 (1), 501-502 (2003).
  16. Asturiano, J., et al. Physio-chemical characteristics of seminal plasma and development of media and methods for the cryopreservation of European eel sperm. Fish Physiol. Biochem. 30 (3), 283-293 (2004).
  17. Szabó, G., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm using different extenders and cryoprotectants. Acta. Biol. Hung. 56 (1-2), 173-175 (2005).
  18. Müller, T., et al. Cryopreservation of sperm of farmed European eel Anguilla anguilla. J World Aquac Soc. 35 (2), 225-231 (2004).
  19. Peñaranda, D. S., Pérez, L., Gallego, V., Jover, M., Asturiano, J. F. Improvement of European eel sperm cryopreservation method by preventing spermatozoa movement activation caused by cryoprotectants. Cryobiology. 59 (2), 119-126 (2009).
  20. Marco-Jiménez, F., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: effect of dilution ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants. Cryobiology. 53 (1), 51-57 (2006).
  21. Asturiano, J. F., et al. Effect of sperm cryopreservation on the European eel sperm viability and spermatozoa morphology. Reprod. Domestic Anim. 42 (2), 162-166 (2007).
  22. Mordenti, M., Di Biase, A., Sirri, R., Modugno, S., Tasselli, A. Induction of Sexual Maturation in Wild Female European Eels (Anguilla anguilla) in Darkness and Light. Isr. J. Aquac. 64, (2012).
  23. Ohta, H., et al. Artificial induction of maturation and fertilization in the Japanese eel, Anguilla japonica. Fish Physiol. Biochem. 17 (1), 163-169 (1997).
  24. Tanaka, S., et al. Long-term cryopreservation of sperm of Japanese eel. J. Fish Biol. 60 (1), 139-146 (2002).
  25. Gallego, V., et al. Subpopulation pattern of eel spermatozoa is affected by post-activation time, hormonal treatment and the thermal regimen. Reprod. Fertil. Dev. 27 (3), 529-543 (2015).
  26. Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, &. #. 1. 9. 3. ;. Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. , (2016).
  27. Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 130 (4), 425-433 (2001).
  28. Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
  29. Verstegen, J., Iguer-Ouada, M., Onclin, K. Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57 (1), 149-179 (2002).
  30. Magnotti, C., et al. Cryopreservation and vitrification of fish semen: a review with special emphasis on marine species. Rev. Aquacult. , (2016).
  31. Dziewulska, K., Rzemieniecki, A., Czerniawski, R., Domagała, J. Post-thawed motility and fertility from Atlantic salmon (Salmo salar L.) sperm frozen with four cryodiluents in straws or pellets. Theriogenology. 76 (2), 300-311 (2011).
  32. Babiak, I., Bolla, S., Ottesen, O. Suitable methods for cryopreservation of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L. Aquac. Int. 16 (6), 561-572 (2008).
  33. Müller, T., et al. Japanese eel (Anguilla japonica Temminck & Schlegel, 1846) propagation using cryopreserved sperm samples. J. Appl. Ichthyol. 33 (3), 550-552 (2017).

Play Video

Cite This Article
Herranz-Jusdado, J. G., Kása, E., Kollár, T., Gallego, V., Peñaranda, D. S., Rozenfeld, C., Pérez, L., Horváth, Á., Asturiano, J. F. Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation. J. Vis. Exp. (131), e56835, doi:10.3791/56835 (2018).

View Video