処理と治療の男性欧州ウナギ (アンギラ) ホルモンの成熟、精子凍結保存
Summary
ヨーロッパのウナギの成熟と精子の凍結保存のためのプロトコルは、最後の年にわたって改善されています。この資料では、成熟と保護剤の検討としてメタノールを誘発するひと絨毛性ゴナドトロピン (hCG) で使用可能な最適なプロトコルについて説明します。
Abstract
最後年の間にいくつかの研究グループは開発とヨーロッパのウナギ処理と成熟の新しいプロトコルの改善に取り組んでいます。としてまだ、ひと絨毛性ゴナドトロピン (hCG) の毎週の注射は治療の数週間中に質の高い精子の大量の生産わずか 5-6 週間後の男性の成熟に証明しています。さらに、精子凍結保存のプロトコルが異なるエクステンダーを使用して、凍結保護剤と冷却時間を解凍以前について記載されているヨーロッパのウナギ。ここで、紹介受精、凍結保存、Tanaka´s ・ エクステンダー ・ ソリューションが直接使用することができます不要な解決方法および希薄のさまざまな種類の使用法を作るします。さらに、このプロトコルにはメタノールは毒性が低いと、精子をアクティブにしません、保護剤の検討としてメタノールを使用では使いやすいのものとなります。精子は、保護剤の検討、添加後すぐに凍結保存する必要はありません、解凍されて後に長く使用できます。また、精子の運動性は新鮮な精子のそれより低いが融解後依然として高いです。この作業の目的は、ヨーロッパウナギの最高の利用可能なプロトコル処理、成熟、精子凍結保存を表示することです。
Introduction
過去 25 年間欧州ウナギ (アンギラ) ヨーロッパの海岸に到着の数は 90 1,2,3で着実に減少しています。汚染、感染症、乱獲や生息地の破壊を含む抜本的な低下を説明するいくつかの要因があります。これのすべてが重要な絶滅危惧種4としての性質 (IUCN) リストのための国際連合のヨーロッパのウナギを含めることにつながる、この種に大きな影響を与える。その結果、技術や飼育下で繁殖のためのプロトコルの開発が必要です。
捕われの身でヨーロッパのウナギの成熟はホルモン治療5,6,7によって達成されるが、雌雄の配偶子の生産は8を同期することは困難。ウナギ9,の形成を加速する新しいアンドロゲン インプラントの開発を示しているにもかかわらず10女性に最終的な成熟のタイミングはまだ変化して11を制御することは困難。したがって、精子12,13,14および凍結保存技術の短期的なストレージ、繁殖管理、配偶子同期不要な8を作るために必要です。
2003 15,16以来ヨーロッパうなぎ精子の凍結保存をしました。いくつかの研究では、凍結保護剤16,17,18,19,20としてジメチルスルホキシド (DMSO) やメタノールのいずれかを使用して成功したプロトコルを設計されています。両方のプロトコルが正常に使用されているが、DMSO を凍結保存後解凍精子の細胞生存率はメタノール20,21より低い。また、うなぎ精子は DMSO との接触で活性化されより退屈な精子操作19が必要です、そのためメタノールより適切な保護剤の検討欧州ウナギ精子の DMSO よりも。
ここでは、最適なハンドリングとヨーロッパのウナギのホルモン治療のプロトコルは、以下に記載します。これに加えて、この種の精子の質の評価のため、保護剤の検討とプロトコルとしてメタノールを使用して最高のヨーロッパウナギ精子凍結プロトコルは説明もします。
Protocol
このプロトコルで記述されているヨーロッパのウナギを操作するためのすべての手順は、次の実験を制御するスペイン法令、大学パラオレイ ・ デ ・ バレンシアで動物実験倫理委員会によって承認されたと生きている動物のプロシージャ。 1. 魚の維持 研究施設にヨーロッパのウナギをもたらすと循環システムの 200 L 水槽に入れてください。定数 20 ° C の温度を?…
Representative Results
70% 以上精子の運動と 18 ウナギから精子はこの研究に選ばれました。新鮮な精子 (表 1および図 2) からのそれらと比較して融解した後、結果はすべての品質パラメーターの減少を示した。運動の結果 (意味 ± S.E.M.、n = 18) 総運動と解凍後精子サンプルは、進歩的な運動よりも新鮮な精子で高い総運動と進歩的な運動性を示した。 <p …
Discussion
このプロトコルでは、ヨーロッパのウナギの成熟、処理および精子凍結保存の完全なプロセスについて説明します。ここで説明する飼育条件は早く成熟とこの種6,7,25で質の高い精子の大量生産のため最適です。この凍結プロトコルとその潜在的な解凍後受精の成功は新鮮な精子26の品質に大きく依存しま?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
欧州連合のホライゾン 2020年研究によって資金が供給されたこの文書および革新プログラム マリアスクウォドフスカ キュリー付与契約の下で 642893 (インプレス) コスト オフィス (アクション コスト FA 1205, AQUAGAMETE)、および優れた研究センター-1476-4/2016/FEKUT。
Materials
| AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 | AQUACEN | 3394ESP | Benzocaine |
| NaCl | Avantor | 3624-19 | |
| Syringe | BD Plastipak | 305501 | Syringe 1 mL |
| FC500 | Beckman Coulter | Flow cytometer | |
| Air pump 100 | EHEIM | 4011708370032 | Modified for suction |
| Eppendorf 1.5 | Eppendorf | 175508 | Plastic tubes 1.5 mL |
| Falcon tubes | Falcon | 175747 | Plastic tubes 15 mL |
| Flexible bucket | Fiel | 1040101 | 40 L, Black color. |
| Ethanol | Guinama SL | Mg96270 | |
| Cyopreservation straws | IMV Technologies | 14550 | 500 µL straws |
| Live/Dead Sperm Viability Kit | Invitrogen | L7011 | Cytometer Kit |
| Modelling clay | JOVI | Art 30 | 4 different colors |
| Precision scale PCB | KERN & Sohn GmbH | PCB35002 | Digital scale |
| Saline solution Vitulia 0.9% | Laboratorios Ern, S.A. | C.N. 999790.8 | Saline solution |
| Forceps | Levantina de Lab. SL | 3710025 | 30 cm metal forceps |
| Scissors | Levantina de Lab. SL | 3700014 | Scissors 14cm |
| Ovitrelle (r-hCG) | Merck SL | EMEA/H/C/000320 | Human chorionic gonadotropin |
| Nikon Eclipse 80i | Nikon | Microscope | |
| CaCl2 | Panreac Quimica SAU | 2112211210 | |
| Na2SO4 | Panreac Quimica SAU | 3257091611 | |
| NaHCO3 | Panreac Quimica SAU | 1416381210 | |
| 782M Camera | Proiser | 782M | Camera for CASA |
| ISAS v1 | Proiser | ISAS v1 | CASA software |
| SpermTrack-10 | Proiser | SpermTrack-10 | Countig chamber for CASA |
| Beaker Pyrex 3L | PYREX | 2110668 | Glass beaker 3L |
| Flask Pyrex 250 GL-45 | PYREX | 21801365 | Glass flask 250 mL |
| KCl | Scharlab SL | PO02000500 | |
| Methanol | Scharlab SL | ME03061000 | |
| MgCl2 | Scharlab SL | MA00370500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 05482 | Bovine serum albumina |
| Styrofoam box | 34x34x30 cm and 5cm thick |
References
- ICES_Working_Group_on_Eels. . Report of the 2011 Session of the Joint EIFAAC/ICES Working Group on Eels. , 246 (2011).
- Moriarty, C. European Catches of Elver of 1928-1988. Int. Rev. Hydrobiol. 75 (6), 701-706 (1990).
- Dekker, W. The fractal geometry of the European eel stock. ICES J. Mar. Sci. 57 (1), 109-121 (2000).
- Jacoby, D., Gollock, M. . Anguilla anguilla. The IUCN red list of threatened species. Version 2014.2. , (2014).
- Asturiano, J. F., et al. Effects of hCG as spermiation inducer on European eel semen quality. Theriogenology. 66 (4), 1012-1020 (2006).
- Pérez, L., et al. Induction of maturation and spermiation in the male European eel: assessment of sperm quality throughout treatment. J. Fish Biol. 57 (6), 1488-1504 (2000).
- Gallego, V., et al. Study of the effects of thermal regime and alternative hormonal treatments on the reproductive performance of European eel males (Anguilla anguilla) during induced sexual maturation. Aquaculture. 354, 7-16 (2012).
- Asturiano, J. F., Sørensen, S. R., Pérez, L., Lauesen, P., Tomkiewicz, J. First Production of Larvae Using Cryopreserved Sperm: Effects of Preservation Temperature and Cryopreservation on European Eel Sperm Fertilization Capacity. Reprod. Domestic Anim. 51 (4), 485-491 (2016).
- Di Biase, A., et al. Co-treatment with androgens during artificial induction of maturation in female eel, Anguilla anguilla: Effects on egg production and early development. Aquaculture. 479, 508-515 (2017).
- Lokman, P., Wylie, M. J., Downes, M., Di Biase, A., Damsteegt, E. L. Artificial induction of maturation in female silver eels, Anguilla australis: The benefits of androgen pre-treatment. Aquaculture. 437, 111-119 (2015).
- Mylonas, C. C., Duncan, N. J., Asturiano, J. F. Hormonal manipulations for the enhancement of sperm production in cultured fish and evaluation of sperm quality. Aquaculture. , (2016).
- Ohta, H., Izawa, T. Diluent for cool storage of the Japanese eel (Anguilla japonica) spermatozoa. Aquaculture. 142 (1-2), 107-118 (1996).
- Peñaranda, D. S., et al. European Eel Sperm Diluent for Short-term Storage. Reprod. Domestic Anim. 45 (3), 407-415 (2010).
- Ohta, H., Kagawa, H., Tanaka, H., Unuma, T. Control by the environmental concentration of ions of the potential for motility in Japanese eel spermatozoa. Aquaculture. 198 (3), 339-351 (2001).
- Asturiano, J., et al. Media and methods for the cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm. Fish Physiol. Biochem. 28 (1), 501-502 (2003).
- Asturiano, J., et al. Physio-chemical characteristics of seminal plasma and development of media and methods for the cryopreservation of European eel sperm. Fish Physiol. Biochem. 30 (3), 283-293 (2004).
- Szabó, G., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm using different extenders and cryoprotectants. Acta. Biol. Hung. 56 (1-2), 173-175 (2005).
- Müller, T., et al. Cryopreservation of sperm of farmed European eel Anguilla anguilla. J World Aquac Soc. 35 (2), 225-231 (2004).
- Peñaranda, D. S., Pérez, L., Gallego, V., Jover, M., Asturiano, J. F. Improvement of European eel sperm cryopreservation method by preventing spermatozoa movement activation caused by cryoprotectants. Cryobiology. 59 (2), 119-126 (2009).
- Marco-Jiménez, F., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: effect of dilution ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants. Cryobiology. 53 (1), 51-57 (2006).
- Asturiano, J. F., et al. Effect of sperm cryopreservation on the European eel sperm viability and spermatozoa morphology. Reprod. Domestic Anim. 42 (2), 162-166 (2007).
- Mordenti, M., Di Biase, A., Sirri, R., Modugno, S., Tasselli, A. Induction of Sexual Maturation in Wild Female European Eels (Anguilla anguilla) in Darkness and Light. Isr. J. Aquac. 64, (2012).
- Ohta, H., et al. Artificial induction of maturation and fertilization in the Japanese eel, Anguilla japonica. Fish Physiol. Biochem. 17 (1), 163-169 (1997).
- Tanaka, S., et al. Long-term cryopreservation of sperm of Japanese eel. J. Fish Biol. 60 (1), 139-146 (2002).
- Gallego, V., et al. Subpopulation pattern of eel spermatozoa is affected by post-activation time, hormonal treatment and the thermal regimen. Reprod. Fertil. Dev. 27 (3), 529-543 (2015).
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, &. #. 1. 9. 3. ;. Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. , (2016).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
- Verstegen, J., Iguer-Ouada, M., Onclin, K. Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57 (1), 149-179 (2002).
- Magnotti, C., et al. Cryopreservation and vitrification of fish semen: a review with special emphasis on marine species. Rev. Aquacult. , (2016).
- Dziewulska, K., Rzemieniecki, A., Czerniawski, R., Domagała, J. Post-thawed motility and fertility from Atlantic salmon (Salmo salar L.) sperm frozen with four cryodiluents in straws or pellets. Theriogenology. 76 (2), 300-311 (2011).
- Babiak, I., Bolla, S., Ottesen, O. Suitable methods for cryopreservation of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L. Aquac. Int. 16 (6), 561-572 (2008).
- Müller, T., et al. Japanese eel (Anguilla japonica Temminck & Schlegel, 1846) propagation using cryopreserved sperm samples. J. Appl. Ichthyol. 33 (3), 550-552 (2017).
Cite This Article
Herranz-Jusdado, J. G., Kása, E., Kollár, T., Gallego, V., Peñaranda, D. S., Rozenfeld, C., Pérez, L., Horváth, Á., Asturiano, J. F. Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation. J. Vis. Exp. (131), e56835, doi:10.3791/56835 (2018).