Summary

Экспериментальный протокол для обнаружения митохондриальной функции в гепатоцитах, подвергшихся воздействию органохлорных пестицидов

Published: September 16, 2020
doi:

Summary

Понимание влияния экологических органохлоринных пестицидов (OCPs) на митохондриальную функцию в гепатоцитах имеет важное значение для изучения механизма OCPs вызывает нарушения обмена веществ. В настоящем документе представлены подробные методы обнаружения печеночным митохондриальной функции.

Abstract

В настоящем документе представлены подробные методы обнаружения печеночным митохондриальной функции для лучшего понимания причины метаболических нарушений, вызванных экологическими органохлоринными пестицидами (OCPs) в гепатоцитах. Клетки HepG2 подвергались воздействию гексахлороциклогексана (З-ГХГ) в течение 24 ч при эквивалентной дозе внутреннего воздействия в общей популяции. Ультраструктура в гепатоцитах была исследована с помощью электронной микроскопии передачи (TEM), чтобы показать повреждение митохондрий. Митохондриальная функция была дополнительно оценена по интенсивности митохондриальной флуоресценции, уровням аденозина 5′-трифосфата (АТФ), скорости потребления кислорода (OCR) и митохондриальному мембранальному потенциалу (MMP) в клетках HepG2, инкубированных С-ГХГ. Интенсивность митохондрий флуоресценции после окрашенных митохондриального зеленого флуоресцентного зонда наблюдалась с помощью микроскопии флуоресценции. Реакция люциферина-люциферазы была использована для определения уровней АТФ. MMP был обнаружен катионом красителя JC-1 и проанализирован под цитометрией потока. OCR измерялся с помощью внеклеточного анализатора потока. Таким образом, эти протоколы были использованы в обнаружении митохондриальной функции в гепатоцитах с для исследования повреждений митохондрий.

Introduction

Влияние органохлорных пестицидов (OCPs) на здоровье, например, репродуктивное вмешательство, иммунологическая токсичность, метаболические изменения былиранее изучены 1,,2,,3. Методы обнаружения клеточного метаболизма и выявления митохондриальной дисфункции позволили ученым понять роль митохондриальной функции,,,(т.е.митохондриальных уровней STAT3,лактата, пирувата, соотношения лактата к пирувату,коэнзима No10, митохондриальной утечки протонов, биоэнергетики, биогенеза идинамики) втакихобластях, как старение, ожирение, диабет, сердечно-сосудистая функция, рак и токсичность.6 В этом документе мы описываем методы оценки митохондриальной дисфункции, вызванной OCPs.

Мы подвергли клетки HepG2 воздействию гексахлороциклогексана (З-ГХГ), одного репрезентативного OCP, на 24 ч в дозе, эквивалентной внутреннему воздействию человека. Во-первых, TEM был применен для наблюдения за ультраструктурой гепатоцитов, таких как ядра, митохондрии и эндоплазмическийритикулум 8. По сравнению с обычными микроскопами, TEM позволяет исследовать 2D и 3D ультра-структуру клеток и клеточных компонентов (клеточные линии или ткани), морфологию, химический состав, а также функции природных или искусственных материалов, которые играют ключевую роль в современной науке и технике. Митохондриальная функция была дополнительно оценена по интенсивности митохондриальной флуоресценции, уровням аденозина 5′-трифосфата (АТФ), скорости потребления кислорода (OCR) и митохондриальному мембранальному потенциалу (MMP) в клетках HepG2, инкубированных С-ГХГ. Мито-трекер зеленый митохондрии зеленый флуоресцентный зонд, который может быть использован для живых клеток митохондриальных флуоресцентных окрашивания. Митохондрии в гепатоцитах были окрашены мито-трекер зеленый раствор и митохондриальной интенсивности флуоресценции, количество и картина наблюдались с конфокальноймикроскопии 9. Митохондриальный зеленый флуоресцентный зонд может быть использован для окрашивания живых клеток. По сравнению с роданом 123 или JC-1 митохондриальный зеленый флуоресцентный зонд не зависит от митохондриального мембранного потенциала митохондриального окрашивания. Уровни АТФ определялись набором люциферазы-люциферина и нормализовались концентрацией белка. Набор анализа АТФ может быть использован для обнаружения уровней АТФ в общих растворах, клетках или тканях. Этот комплект основан на светлячка люцифераза катализа флуоресценции для создания флуоресценции, когда АТФ требуется для обеспечения энергией. Когда светлячок люцифераза и флуорессейн являются чрезмерными, в определенном диапазоне концентрации, генерация флуоресценции пропорциональна концентрации АТФ. Кроме того, этот комплект был специально разработан для оптимизации химилюминесценции АТФ. АТФ, как наиболее важные молекулы энергии, играет важную роль в различных физиологических или патологических процессах клеток. Изменения в уровнях АТФ могут отражать дефекты в функции клеток, особенно митохондриальной выработки энергии. Обычно при апоптозе, некрозе или в каком-то токсичном состоянии уровень клеточного АТФ снижается на 10. MMPs анализ комплект с JC-1 является комплект, который использует JC-1 в качестве флуоресцентного зонда для обнаружения клеток, тканей или очищенных MMPs быстро и чувствительно. Он может быть использован для раннего выявления апоптоза. Катионый краситель JC-1 является флуоресцентным зондом, используемым для обнаружения MMP, который может быть проанализирован под цитометрией потока, указанной изменениями зеленого и красного соотношения флуоресценции. Когда MMP высок, JC-1 агрегируется в матрице митохондрий, чтобы сформировать полимер (J-агрегаты), который производит красную флуоресценцию. Когда MMP низок, JC-1 не может накапливаться, и образует мономер, который производит зеленую флуоресценцию11. Таким образом, соотношение красной и зеленой флуоресценции может отражать уровень MMP. OCR клеток является важнейшим показателем нормальной клеточной функции12. Он рассматривается как параметр исследования митохондриальной функции. Комплект стресс-теста Cell mito обеспечивает стабильный метод анализа ключевых параметров митохондриальной функции. Комплект обеспечивает контроль качества и прогностические реагенты, а также стандартный метод для выполнения клеточного митохондриального стресс-теста. Он может быть использован для обнаружения всех типов клеток, в том числе первичных клеток, клеточных линий, подвесных клеток, а также для островков, нематод, дрожжей и изолированных митохондрий.

Измерение OCR может обеспечить ценное понимание физиологического состояния или изменения клеток. Он был определен с помощью внеклеточного анализатора потока для обнаружения дыхания базовых, протонной утечки, максимальных дыхательных путей, оборота АТФ и резервной мощности. Короче говоря, после базовых измерений OCR, OCR был обнаружен после последовательного добавления к олигомицину (ATP Coupler), FCCP (митохондриальное окислительное фосфорилирование uncoupler) и антимицин а/ротенон (ингибитор потребления кислорода) на колодец.

В целях содействия разработке более конкретного протокола для обнаружения митохондриальной функции в гепатоцитах in vitro, мы представляем здесь эксперименты TEM, конфокальной микроскопии, люминометра, цитометра потока и внеклеточного анализатора потока с будущим применением в изучении митохондрий повреждения, связанные с неблагоприятными исходами.

Protocol

Все эксперименты и протоколы экспериментов проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами и были одобрены местным комитетом по этике Нанкинского медицинского университета. 1. Митохондриальная ультраструктура TEM Сбор клеток HepG2<…

Representative Results

Митохондрии cristae клеток HepG2 подвергаются К-ГХГ были заметно повреждены. Рассеянные митохондрии были слегка заметно расширены, неправильной формы, и митохондриальный хребет исчез с относительно ненормальной митохондриальной архитектурой(рисунок 1). …

Discussion

Решающее значение для успеха протокола обнаружения имеет использование различных экспериментальных методов, которые были охвачены исследования от фенотипа к механизму. В этом исследовании клетки HepG2 были откоучались в DMEM с пенициллином и стрептомицином и 10% сыворотки крупного рогато…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (Grant No 81573174, 81570574); Выдающийся молодежный фонд провинции Цзянсу (SBK2014010296); исследовательский проект Министерства образования Китая (213015A); приоритетная академическая программа развития высших учебных заведений Цзянсу (PAPD), флагманское крупное развитие высших учебных заведений Цзянсу; и Программа открытого проекта Государственной ключевой лаборатории экологической химии и экотоксикологии (KF2015-01).

Materials

Transmission electron microscope  FEI Tecnai G2 Spirit Bio TWIN High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance
Mito-Tracker Green Beyotime C1048 Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining.
Laser scanning confocal microscope Zeiss 700B The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to  produce a perfect 3-dimensional specimen image.
Enhanced ATP Assay Kit Beyotime S0027 Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes.
Luminometer Berthold Centro LB 960 Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence.
BCA Protein Assay Kit Beyotime P0012 BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations.
Multimode reader TECAN InfiniteM200 Multimode reader be used to detect protein consentration.

References

  1. Rantakokko, P., et al. Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study. Environ Health. 14, 79 (2015).
  2. Mrema, E. J., et al. Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity. Toxicology. 307, 74-88 (2013).
  3. Dirinck, E., et al. Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls. Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).
  4. Genini, D., et al. Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
  5. Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. M. Molecular hydrogen affects body composition, metabolic profiles, and mitochondrial function in middle-aged overweight women. Ir J Med Sci. , (2017).
  6. Gonzalez-Franquesa, A., Patti, M. E. Insulin Resistance and Mitochondrial Dysfunction. Adv Exp Med Biol. 982, 465-520 (2017).
  7. Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Adv Exp Med Biol. 982, 359-370 (2017).
  8. Cheville, N. F., Stasko, J. Techniques in electron microscopy of animal tissue. Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).
  9. Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes. Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).
  10. Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
  11. Reitman, Z. J., et al. Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia. J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).
  12. Nelson, J. A. Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements. J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).
  13. Liu, Q., et al. Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism. Sci Rep. 7, 46339 (2017).
  14. Tien, T., et al. High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).
  15. Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release. Cell Death Dis. 8 (6), 2853 (2017).
  16. Jaiswal, M. K. Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Front Cell Neurosci. 10, 295 (2016).
  17. Song, E., et al. Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress. Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).
  18. Li, Y., et al. Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria. Food Chem. 234, 62-67 (2017).
  19. Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells. Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).
  20. Mayor, F., et al. G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis. Cell Signal. , (2017).
  21. Clark, A., Mach, N. The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise. Front Physiol. 8, 319 (2017).
  22. Robicsek, O., et al. Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder. Schizophr Bull. , (2017).
  23. Akinrotimi, O., et al. Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes. Hepatology. , (2017).
  24. Rosa, A. I., et al. Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson’s disease. Biochim Biophys Acta. , (2017).
  25. Matondo, A., Kim, S. S. Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease. J Drug Target. , 1-30 (2017).

Play Video

Cite This Article
Liu, Q., Jiang, Z., Gu, A. Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides. J. Vis. Exp. (163), e56800, doi:10.3791/56800 (2020).

View Video