جمع بعد التزاوج السائل المنوي من الإناث المسالك التناسلية وقياس لتسييل المني في الفئران
Summary
مطلوب تميع السائل المنوي للحيوانات المنوية أن يتحرر من هلام المنوي. وتوفر هذه الدراسة إجراءات جمع السائل المنوي من الجماع بعد انتهاء الأنثى التناسلي، وقياس الوقت تميع السائل المنوي.
Abstract
في الفئران، تودع أنزل المني في الرحم. يتغير السائل المنوي بعد القذف، الاتساق من جل تشبه إلى مائي، تسمى عملية تسييل. في هذه الدراسة، علينا إظهار كيفية جمع السائل المنوي بعد اجاكولاتيد من المسالك التناسلية الإناث في طراز ماوس. أولاً، الكبار الفئران الإناث في مرحلة السفاد داخل قفص الذكور بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، أكدت وجود المكونات كوبولاتوري في افتتاح المهبل الجماع. كانت الفئران الإناث مع المقابس copulatory euthanized، وجمعت كل التناسلي ككل (المهبل، الرحم، أوفيدوكتس، والمبايض)، ضمان نظام مغلق لاحتواء السائل المنوي. وضع المسالك التناسلية في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، وانقطع المهبل بالإفراج عن السائل المنوي في الأنبوب. للتأكد من حجم السائل المنوي كحد أقصى للتحليل، استخدمت الملقط بلا أسنان للضغط على قرون الرحم من المبيض نهاية إلى نهاية المهبل طرد السائل المنوي المتبقية. ثم تم تجاهلها كلياً التناسلي. كان نسج الأنبوبة المحتوية على السائل المنوي بإيجاز إلى أسفل. ماصة شعرية 25 ميكروليتر وضعت في أنبوب بزاوية 180 درجة (موازية لجدار الأنبوبة). تم تسجيل مقدار الوقت المستخدم لملء الأنبوب الشعرية إلى السطر 25 ميكروليتر. وعادة ما يستغرق السائل المنوي من مربي ذكور ثبت حوالي 60-180 s لملء أنبوب شعري 25 ميكروليتر. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب جمع السائل المنوي في التطبيقات الأخرى المتلقين للمعلومات مثل تحليل التصوير وحركية الحيوانات المنوية.
Introduction
وتتألف التناسلي الإناث المسالك العلوي والسفلي. ويشمل المسالك التناسلية العليا فالوب والرحم، واندوسيرفيكس. ويشمل التناسلي السفلي في اكتوسيرفيكس والمهبل. في البشر، وهو إيداع السائل المنوي اجاكولاتيد في الجدار الأمامي للمهبل، المتاخمة لل اكتوسيرفيكس1. في الفئران، ولكن السائل المنوي هو اجتاحت الرحم في غضون دقائق بعد التزاوج2.
السائل المنوي يحتوي على جل المنوي هو توطد في غضون ثوان قذف، مما تسبب في الحيوانات المنوية تكون شرك والمعطل تداولها3. تسييل النشرات الحيوانات المنوية المعطل تداولها بتغيير السائل المنوي من جل تشبه إلى اتساق مائي. هذه العملية ضروري لعدد الحيوانات المنوية الحركة واستنساخ الثدييات. معظمها يستند إلى المعرفة تميع السائل المنوي في المختبر الدراسات حيث يصبح المني المسال في صحن ثقافة. في البشر، والنشاط الأنزيمي مستضد البروستات محددة أو هيكل السلام والأمن (المعروف أيضا كاليكرين المتصلة peptidase 3 أو KLK3) هو المساهم الرئيسي لاسالة عن طريق التحلل المائي سيمينوجيلينس (هلام تشكيل البروتينات الموجودة في السائل المنوي)4 ،،من56. تدهور سيمينوجيلينس تحرر الحيوانات المنوية من coagulum المنوي، زيادة تنقل الحيوانات المنوية. أطلق سراح الحيوانات المنوية تسبح نحو قناة فالوب لتخصيب البويضة. تسييل (أو لزوجة السائل المنوي) الاختبارات واحدة من العروض الأولية القياسية لتحليل السائل المنوي في عيادات الخصوبة لتقييم خصوبة الذكور7.
مقال نشر مؤخرا تبين أن تحليل السائل المنوي التي جمعت من الماوس الأنثى التناسلي بعد التزاوج يمكن استخدامها لتوضيح قصورا في تسييل وبعد ذلك يمكن أن يسبب الخصوبة العيوب8. تسييل معيبة مثل هايبرفيسكوسيتي السائل المنوي يساهم 11.8-32.3 في المائة حالات العقم في الرجال9، مما يوحي بأن اسأله عادية لا غنى عنه لاستنساخ الثدييات. ومع ذلك، ركزت الدراسات وعلاج العيوب تسييل حصرا على الذكور7. لم تستكشف إمكانية أن الأنثى التناسلي يلعب دوراً في تميع السائل المنوي. ولذلك، سيوفر طرق جمع السائل المنوي وقياس الوقت تسييل الباحثين أداة تشخيصية جديدة لتحديد سواء تسييل يمكن أن يكون واحداً من أسباب العقم في الكائن الحي النموذجي للفائدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
جمع السائل المنوي من الماوس التي يمكن أن توفر مزايا أكثر من السائل المنوي تحليل في المختبر كما السابق ويمكن توضيح التفاعلات الفسيولوجية بين السائل المنوي والإفرازات من الأنثى التناسلي. تسمح التقنيات المعروضة في هذه الدراسة الباحثين لتحديد نوعية السائل المنوي وكذلك بقاء الحيوا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل كلية الطب البيطري (WSU) بدء الصندوق إلى WW. يشكر المؤلفون سييرا أولسن (WSU) لقراءة نقدية لهذه المخطوطة.
Materials
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
References
- Suarez, S. S., Pacey, A. A. Sperm transport in the female reproductive tract. Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).
- Bedford, J. M., Yanagimachi, R. Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster. J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).
- Lilja, H. Cell biology of semenogelin. Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).
- Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa. J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).
- Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches. Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).
- Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction. J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).
- Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program. Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).
- Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo. PLoS Genet. 13 (4), e1006743 (2017).
- Elia, J., et al. Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects. Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).
- Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , (2017).
- Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).
- Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid. Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).
