Summary

Mettede fettsyrer indusere celledød Ceramide-assosiert Macrophage

Published: October 31, 2017
doi:

Summary

Vi illustrerer en rett fram metode til å utlede murine primære makrofager fra benmargen celler og en enkel metode å forberede BSA-fettsyrer conjugates. Deretter viser vi at mettede fettsyrer kan indusere macrophage celledød, og slike celledød er positivt assosiert med mobilnettet akkumulering av ceramide nivåer.

Abstract

Makrofager uttrykke svært epidermal fettsyrer-bindende protein og adipose fettsyrer-bindende protein. De aktivt opptak mettet og umettede fettsyrer, som kan spille en avgjørende rolle i å regulere deres immun funksjoner. Mange studier har vist at ulike fettsyrer, mettet eller umettede, kan ha ulike virkninger på cellevekst og funksjon. Men varierer tilnærmingene brukt for fettsyrer forberedelse, som kan føre til ikke-fysiologiske resultater. Serum albumin, en naturlig operatør for fettsyrer i pattedyr perifert blod, anbefales for å danne en konjugert med salt natrium fatty syren å studere fettsyrer funksjon i pattedyrceller, således minimere toksisitet av fettsyrer såpe. Dermed er en enkel, relativt rask oppvarming og sonicating metoden utviklet og presenteres her for BSA fatty acid konjugat formasjonen. Vi beskriver en protokoll som mettede fettsyrer, spesielt sted syren å indusere alvorlig celledød i musen benmarg avledet makrofager. Videre viser vi at mettede fettsyrer-indusert celledød er positivt assosiert med akkumulert mobilnettet ceramide nivåer. Denne metoden kan utvides for studier av effekten av fettsyrer på andre pattedyrceller.

Introduction

Fettsyrer spille en avgjørende rolle i energi metabolisme og syntese av membran fosfolipider i forskjellige celler. Fettsyrer har en lav vandig oppløselighet. Aktuelle utarbeidelse av fettsyre er av avgjørende betydning for å studere biologiske funksjoner av fettsyrer i pattedyrceller. Når fettsyrer er forberedt med etanol, kan mange fettsyrer viser deres giftige såpe (vaskemiddel) effekt på cellemembranen, selv i relativt lave konsentrasjoner1. Som en naturlig, store transporter for frie fettsyrer i serum, serum albumin er ansett som en god transportør for fettsyrer levering i vitro fettsyrer funksjonen analyser2,3,4. Detaljer om utarbeidelse av fettsyre og serum albumin konjugert er imidlertid vanligvis ikke tilgjengelig selv om mange oppgaver ved hjelp av fettsyrer har blitt publisert.

Makrofager uttrykke svært epidermal fettsyrer-bindende protein og adipose fettsyrer-bindende protein5,6,7,8. De aktivt opptak mettet og umettede fettsyrer som kan regulere deres immun funksjoner. For å studere virkningen av fettsyrer makrofager og andre celler, var forskjellige metoder for fettsyrer forberedelse anvendt1,7,9. Bruke riktig forberedt fettsyrer/serum albumin conjugates for å undersøke virkningen av fettsyrer på macrophage funksjon er av avgjørende betydning i å skaffe biologisk meningsfull data. Studier av effekten av fettsyrer på macrophage funksjon kan gi grunnleggende kunnskaper og potensielle terapeutiske mål knyttet til metabolismen av fettsyrer i macrophage-involvert sykdommer.

Protocol

protokollen ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) på Universitetet i Louisville. 1. musen benmarg avledet makrofager (BMDMs) Euthanize en 6 – til 8-uke-gamle, sunn vill-type mus ved hjelp av CO 2. Feste det til et skum bord og spray den med 70% etanol før det er gjennomvåt. Fjerne tibia/femur Ben med tang og saks. Legg dem i en Petriskål med 5 mL 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS). Utfører alle prosedyrer under sterile forhold. <l…

Representative Results

Fedme øker frie fettsyrer konsentrasjonene i serum. Som profesjonell phagocytes tar makrofager aktivt opp fatty syren å opprettholde vert homeostase. Under disse prosessene, kan overbelastet lipider indusere macrophage celledød. Dette kultivert vi BMDMs i vitro med overvektige kosttilskudd fettsyrer og målt macrophage celledød bruker flyt cytometric flekker. Sammenlignet med kontrollen BSA, mettede fettsyrer, indusert spesielt sted syrer, betydelig celledød BMDMs. døde cel…

Discussion

Riktig utarbeidelse av fettsyre løsning er av avgjørende betydning å studere biologiske funksjonen av fettsyrer. Nøytralisering av fettsyrer øker løselighet i vandig løsning. Natrium salter av fettsyrer, spesielt mettede fettsyrer, er imidlertid fortsatt av lav oppløselighet i vann eller PBS vi observert. En metode er å bruke 95-100% etanol til å oppløse fettsyrer1. Bruker denne metoden, kan høyere toksisitet celler sees selv i lave konsentrasjoner for mindre giftige umettede fettsyrer…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble delvis støttet av universitetet i Louisville oppstart midlene og National Cancer Institute (Bethesda, MD) gir R01CA177679, R01CA180986.

Materials

CPX Ultrasonic Bath  Bransonic Model 2800
Sodium palmitate (PA) Nu-Chek Prep, Inc. S-1109 M.W. 278
Sodium stearate (SA) Nu-Chek Prep, Inc. S-1111 M.W. 306
Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free Fisher Scientific 9048-46-8
Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF)  Cell Signaling Technology,  Inc. 5228
RPMI 1640 VWR International 71002-878
Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate Fisher Scientific A13201
7-AAD BD Biosciences 559925
Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) Sigma C8104-50TST Clone: MID 15B4
Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate Sigma AP128F
Fixation buffer Biolegend 420801
Permeabilization buffer Ebioscience 4307693
Red Blood Cell Lysis Buffer  Sigma 11814389001
Annexin V Binding Buffer BD Biosciences 556454
L929 cells ATCC CCL-1
Corning Cell Lifter  Fisher Scientific 07-200-364
Note: M.W. is for molecular weight.

References

  1. Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
  2. Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
  3. Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
  4. Vusse, G. J. Albumin as fatty acid transporter. Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).
  5. Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
  6. Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
  7. Wen, H., et al. Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).
  8. Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
  9. Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
  10. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. , (2008).
  11. Dansen, T. B., et al. High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2). Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).
  12. Ulloth, J. E., et al. Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death. Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).

Play Video

Cite This Article
Zhang, Y., Hao, J., Sun, Y., Li, B. Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death. J. Vis. Exp. (128), e56535, doi:10.3791/56535 (2017).

View Video