Насыщенные жирные кислоты вызывают Церамид связанные макрофагов клеточной смерти
Summary
Мы иллюстрируем прямой метод для получения мышиных первичной макрофагов из клеток костного мозга и простой метод для подготовки BSA-жирные кислоты конъюгатов. Затем мы продемонстрировать, что насыщенные жирные кислоты может вызвать гибель клеток макрофагального и такие смерти клетки положительно связаны с сотовой накопления Церамид уровней.
Abstract
Макрофаги высоко Экспресс эпидермальный белок, связывающий жирные кислоты и жировой белок, связывающий жирные кислоты. Они активно усвоение насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, которые могут играть важную роль в регулировании их иммунных функций. Многочисленные исследования показали, что различные жирные кислоты, насыщенные или ненасыщенные, может иметь различное воздействие на рост клеток и функции. Однако различаются подходы, используемые для подготовки жирных кислот, которые могут привести к не физиологические результаты. Сывороточного альбумина, естественный перевозчиком жирных кислот в периферической крови млекопитающих, рекомендуется для формирования конъюгата комплекс с натриевой соли жирных кислот для изучения функции жирных кислот в клетках млекопитающих, таким образом минимизируя токсичность мыла жирных кислот. Таким образом простой, относительно быстро, Отопление и sonicating метод разработан и представлен здесь BSA-жирные кислоты конъюгата формирования. Мы описываем протокол, с помощью насыщенных жирных кислот, особенно стеариновой кислоты побудить тяжелой клеточной гибели в мыши костного производные макрофагов. Мы далее продемонстрировать положительно связаны с уровнями накопленные сотовой Церамид насыщенных жирных кислот индуцированной клеточную смерть. Этот метод может быть продлено исследования о влиянии жирных кислот на других клеток млекопитающих.
Introduction
Жирные кислоты играют важную роль в метаболизме энергии и синтеза мембранных фосфолипидов в различных видов клеток. Жирные кислоты имеют низкую растворимость водный. Соответствующей подготовки жирные кислоты имеет решающее значение для изучения биологических функций жирных кислот в клетках млекопитающих. Когда жирные кислоты готовятся с этанолом, многие жирные кислоты могут показать их токсичных мыло (детергент) влияние на клеточной мембраны, даже при относительно низких концентрациях1. Естественно, основных транспортер для свободные жирные кислоты в сыворотке крови сывороточного альбумина считается хорошим носителем для жирных кислот доставки в vitro для жирных кислот функция анализы2,,34. Однако детали подготовки жирных кислот и сывороточного альбумина конъюгата обычно не доступны хотя были опубликованы много научных работ с использованием жирных кислот.
Макрофаги высоко Экспресс эпидермальный белок, связывающий жирные кислоты и жировой связывающий жирные кислоты белка5,6,,78. Они активно усвоение насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, которые могут регулировать иммунные функции. Для изучения влияния жирных кислот на другие клетки и макрофаги, различные методы подготовки жирных кислот были прикладной1,7,9. С помощью надлежащим образом подготовленных жирных кислот/сыворотка альбумина конъюгатов для изучения последствий жирных кислот, функции макрофагов имеет решающее значение в получении биологически значимых данных. Исследования о влиянии жирных кислот на функцию макрофагов может обеспечить базовые знания и потенциальных терапевтических целей, касающихся метаболизма жирных кислот в Макрофаг участие заболеваний.
Protocol
Representative Results
Discussion
Надлежащей подготовки жирные кислоты раствор имеет решающее значение для изучения биологической функции жирных кислот. Нейтрализация жирные кислоты увеличивает его растворимости в водном растворе. Однако натриевые соли жирных кислот, особенно насыщенных жирных кислот, по-прежнему н…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддерживается фондами начальный Луисвиллский университет и Национальный институт рака (Бетесда, MD) предоставляет R01CA177679, R01CA180986.
Materials
| CPX Ultrasonic Bath | Bransonic | Model 2800 | |
| Sodium palmitate (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Sodium stearate (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF) | Cell Signaling Technology, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
| Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate | Sigma | AP128F | |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | |
| Permeabilization buffer | Ebioscience | 4307693 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| L929 cells | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Cell Lifter | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Note: M.W. is for molecular weight. |
References
- Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
- Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
- Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
- Vusse, G. J. Albumin as fatty acid transporter. Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).
- Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
- Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
- Wen, H., et al. Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).
- Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
- Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. , (2008).
- Dansen, T. B., et al. High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2). Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).
- Ulloth, J. E., et al. Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death. Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).
