Summary

Насыщенные жирные кислоты вызывают Церамид связанные макрофагов клеточной смерти

Published: October 31, 2017
doi:

Summary

Мы иллюстрируем прямой метод для получения мышиных первичной макрофагов из клеток костного мозга и простой метод для подготовки BSA-жирные кислоты конъюгатов. Затем мы продемонстрировать, что насыщенные жирные кислоты может вызвать гибель клеток макрофагального и такие смерти клетки положительно связаны с сотовой накопления Церамид уровней.

Abstract

Макрофаги высоко Экспресс эпидермальный белок, связывающий жирные кислоты и жировой белок, связывающий жирные кислоты. Они активно усвоение насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, которые могут играть важную роль в регулировании их иммунных функций. Многочисленные исследования показали, что различные жирные кислоты, насыщенные или ненасыщенные, может иметь различное воздействие на рост клеток и функции. Однако различаются подходы, используемые для подготовки жирных кислот, которые могут привести к не физиологические результаты. Сывороточного альбумина, естественный перевозчиком жирных кислот в периферической крови млекопитающих, рекомендуется для формирования конъюгата комплекс с натриевой соли жирных кислот для изучения функции жирных кислот в клетках млекопитающих, таким образом минимизируя токсичность мыла жирных кислот. Таким образом простой, относительно быстро, Отопление и sonicating метод разработан и представлен здесь BSA-жирные кислоты конъюгата формирования. Мы описываем протокол, с помощью насыщенных жирных кислот, особенно стеариновой кислоты побудить тяжелой клеточной гибели в мыши костного производные макрофагов. Мы далее продемонстрировать положительно связаны с уровнями накопленные сотовой Церамид насыщенных жирных кислот индуцированной клеточную смерть. Этот метод может быть продлено исследования о влиянии жирных кислот на других клеток млекопитающих.

Introduction

Жирные кислоты играют важную роль в метаболизме энергии и синтеза мембранных фосфолипидов в различных видов клеток. Жирные кислоты имеют низкую растворимость водный. Соответствующей подготовки жирные кислоты имеет решающее значение для изучения биологических функций жирных кислот в клетках млекопитающих. Когда жирные кислоты готовятся с этанолом, многие жирные кислоты могут показать их токсичных мыло (детергент) влияние на клеточной мембраны, даже при относительно низких концентрациях1. Естественно, основных транспортер для свободные жирные кислоты в сыворотке крови сывороточного альбумина считается хорошим носителем для жирных кислот доставки в vitro для жирных кислот функция анализы2,,34. Однако детали подготовки жирных кислот и сывороточного альбумина конъюгата обычно не доступны хотя были опубликованы много научных работ с использованием жирных кислот.

Макрофаги высоко Экспресс эпидермальный белок, связывающий жирные кислоты и жировой связывающий жирные кислоты белка5,6,,78. Они активно усвоение насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, которые могут регулировать иммунные функции. Для изучения влияния жирных кислот на другие клетки и макрофаги, различные методы подготовки жирных кислот были прикладной1,7,9. С помощью надлежащим образом подготовленных жирных кислот/сыворотка альбумина конъюгатов для изучения последствий жирных кислот, функции макрофагов имеет решающее значение в получении биологически значимых данных. Исследования о влиянии жирных кислот на функцию макрофагов может обеспечить базовые знания и потенциальных терапевтических целей, касающихся метаболизма жирных кислот в Макрофаг участие заболеваний.

Protocol

протокол был одобрен институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из Университета Луисвилл. 1. мыши костного производные макрофагов (BMDMs) Euthanize 6 – до 8-недельных, здоровые дикого типа мыши, с помощью CO 2. Контактный его вниз доска пены и распылить …

Representative Results

Ожирение увеличивает концентрации свободных жирных кислот в сыворотке. Как профессиональные фагоциты макрофаги активно занимают жирных кислот для поддержания гомеостаза хост. В ходе этих процессов перегруженных липидами может вызвать гибель клеток макрофагальног?…

Discussion

Надлежащей подготовки жирные кислоты раствор имеет решающее значение для изучения биологической функции жирных кислот. Нейтрализация жирные кислоты увеличивает его растворимости в водном растворе. Однако натриевые соли жирных кислот, особенно насыщенных жирных кислот, по-прежнему н…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была частично поддерживается фондами начальный Луисвиллский университет и Национальный институт рака (Бетесда, MD) предоставляет R01CA177679, R01CA180986.

Materials

CPX Ultrasonic Bath  Bransonic Model 2800
Sodium palmitate (PA) Nu-Chek Prep, Inc. S-1109 M.W. 278
Sodium stearate (SA) Nu-Chek Prep, Inc. S-1111 M.W. 306
Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free Fisher Scientific 9048-46-8
Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF)  Cell Signaling Technology,  Inc. 5228
RPMI 1640 VWR International 71002-878
Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate Fisher Scientific A13201
7-AAD BD Biosciences 559925
Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) Sigma C8104-50TST Clone: MID 15B4
Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate Sigma AP128F
Fixation buffer Biolegend 420801
Permeabilization buffer Ebioscience 4307693
Red Blood Cell Lysis Buffer  Sigma 11814389001
Annexin V Binding Buffer BD Biosciences 556454
L929 cells ATCC CCL-1
Corning Cell Lifter  Fisher Scientific 07-200-364
Note: M.W. is for molecular weight.

References

  1. Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
  2. Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
  3. Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
  4. Vusse, G. J. Albumin as fatty acid transporter. Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).
  5. Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
  6. Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
  7. Wen, H., et al. Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).
  8. Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
  9. Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
  10. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. , (2008).
  11. Dansen, T. B., et al. High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2). Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).
  12. Ulloth, J. E., et al. Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death. Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).

Play Video

Cite This Article
Zhang, Y., Hao, J., Sun, Y., Li, B. Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death. J. Vis. Exp. (128), e56535, doi:10.3791/56535 (2017).

View Video