Summary

Um ensaio automatizado rápida iterativo Geotaxis negativo para analisar o comportamento de adultos de escalada em um modelo de drosófila de neurodegeneração

Published: September 12, 2017
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Summary

Este passo a passo protocolo analisa o comportamento de geotaxis negativo de drosófila usando um sistema automatizado de vários cilindro que hospeda centenas de moscas e sincroniza a sua acção por um motor elétrico. Após a sincronização, comportamento de voar geotaxis negativo é analisado, digitalmente gravada e analisados utilizando o software RflyDetection auto-concebidos.

Abstract

Doenças neurodegenerativas são frequentemente associadas a uma perda progressiva da capacidade de movimento, esperança de vida reduzida e neurodegeneração idade-dependente. Para entender o mecanismo celular esses eventos e suas relações causais com o outro, Drosophila melanogaster, com as suas sofisticadas ferramentas de genéticas e diversas características comportamentais, são usadas como modelos de doença para avaliar neurodegenerativas fenótipos. Aqui nós descrevemos um método de alta produtividade para analisar o comportamento de adultos geotaxis negativo de Drosophila , como uma indicação para possíveis defeitos motor associado a neurodegeneração. Uma máquina automatizada é projetada e desenvolvida para sincronização de mosca de unidade usando um impulso elétrico inicial, mais tarde, permitindo a gravação de comportamento negativo geotaxis sobre um curso de segundos a minutos. Imagens do vídeo digitalmente gravado então são processadas com o software RflyDetection concebido para manipulação de dados estatísticos. Diferente do ensaio geotaxis negativo manualmente controlado com base em uma única mosca, este protocolo preciso, rápido e alta produtividade permite a aquisição de dados de mais do que centenas de moscas simultaneamente, proporcionando uma abordagem eficiente para avançar a nossa compreensão do mecanismo subjacente de locomoção déficits associados a neurodegeneração.

Introduction

Uma variedade de protocolos e métodos foram desenvolvidos para analisar o comportamento de escalada adulto de Drosophila . Um pouco trabalhosa, a análise tradicional principalmente envolve a colocação de uma única mosca dentro de um frasco de individual e usa uma força manual para tocar voa para baixo para a sincronização1,2,3,4. É tedioso e demorado, impróprios para grandes estudos de alta produtividade e tem potenciais variações da força manual usado para bater para baixo as moscas, bem como outras limitações. Para melhorar o ensaio, um ensaio rápido iterativo negativo Geotaxis (anel) foi desenvolvido, que permite alta produtividade análise sobre numerosas moscas no mesmo tempo5. No entanto, o ensaio ainda requer uma força exercer manualmente para sincronizar a voar para ação. Nossa versão do ensaio do anel, revisado com o ensaio anterior, inclui uma base de metal Hospedagem de vários frascos contendo mosca controlados automaticamente por um motor elétrico para conduzir a sincronização voar6. Após a gravação, a mosca subindo imediatamente após a sincronização é gravada então analisados usando um software concebido. Nosso ensaio de anel automatizado eliminou o processo tedioso e trabalho intensivo em coletar dados de uma única mosca, um de cada vez e habilitado para o processo de aquisição de dados para ser mais eficiente. Além disso, o ensaio automatizado do anel tem sido empregado em uma série de estudos para elucidar a mecanismo subjacente a doença de Alzheimer e doença de Parkinson, validando a abordagem com alta eficiência7,8,9 .

Neste artigo, vamos demonstrar o ensaio automatizado de anel usando o DDC-Gal4 conduzido RNAi moscas. DDC-Gal4 é uma linha de Gal4 especificamente expressando em dopaminérgico (DA) e neurônios serotoninérgicos, representando assim uma ótima ferramenta para analisar os efeitos do gene alvo associados com déficits locomotoras neurodegeneração10de acompanhamento. Além disso, incorporamos UAS-Dicer2, uma linha de mosca que aumenta a eficiência de RNAi, para gerar o UAS-Dicer2; DDC-Gal4 ferramenta linha. As moscas de RNAi escolhemos usar é o auxilin (aux), v16182 de RNAi (auxR16182), um gene que anteriormente identificamos para expor um efeito na atividade locomotora8de voar. auxGFP moscas também são preparadas para analisar os efeitos sobre a superexpressão de aux . Vamos mostrar como usar o ensaio automatizado do anel para medir mosca geotaxis negativa, apresentar os resultados e discutir quaisquer implicações que adquiriu a partir dos resultados.

Protocol

1. coleção voar manter as moscas no padrão alimentar de voar em 25 ° C, umidade de 70% e um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h. Recolher UAS-Dicer2; DDC-GAL4 virginsunder voar de dióxido de carbono (CO 2) anestesia. Atravessar estas virgens para 2 dias de idade moscas machos adultas carregando os seguintes genótipos: UAS-mCD8GFP (controle), auxR 16182 (aux RNAi) auxGFP (aux superexpressão), e auxR 16182…

Representative Results

Este artigo demonstra o uso de um ensaio de anel automatizado em avaliar o comportamento de voar geotaxis negativo. Ao contrário o ensaio anterior do anel, nosso ensaio inclui um aparelho automatizado que fornece uma força elétrica para sincronizar a voar para ação e analisa até centenas de moscas simultaneamente (Figura 1). Análise de Dicer2 de ; DDC > auxR16182 moscas mostraram uma diminuição de idade-dependente à distânc…

Discussion

O ensaio de anel automatizado descrito aqui permite uma análise do elevado-throughput de comportamento de voar geotaxis negativo para centenas de moscas simultaneamente. Anteriormente estratégias existentes para a análise de escalada adulto envolvem observações de uma única mosca em um frasco individual e posição voar manualmente é detectada pelo olho. Este processo um pouco tedioso às vezes pode causar má interpretação ou má interpretação de dados, bem como trabalho trabalhoso. Nosso ensaio automatizado …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos o centro de estoque de Bloomington e centro de RNAi Viena drosófila para estoques de voar. A patente para o aparelho de anel pertence ao Instituto de pesquisas avançadas de Xangai, da Academia Chinesa de Ciências. Pedidos de software RflyDetection deve ser feito para Fu-de Huang (ver lista de autor). Este trabalho foi apoiado por concessões do nacional básica pesquisa programa de China (973 programa 2013CB945602) e Nacional Natural Science Foundation da China (31270825 e 31171043). Agradecemos a membros de laboratório Ho para discussão e comentários.

Materials

Forma Environmental Chamber Thermo  3949
Carbon dioxide cylinders FuLian GAS Technology GB/T6052
HDR-Camcorder SONY HDR-CX220E
Binocular stereomicroscope Xin Zhen SMZ-168BL
Electronic scales MinQiao SL1002N
Refrigerator Haier SC-350
Agar-agar powder Sinopharm 10000561
Glucose Sinopharm 10010518
Corn meal Sinopharm 5464654
Brown sugar LiuCaiYuan 45467936
Instant dry yeast AB MAURI 20886
AuxR16182 VDRC 7187
UAS-Dicer2 Bloomington 24650
UAS-mCD8GFP Bloomington 32185
DDC-Gal4 A gift from Fude Huang
AuxGFP A gift from Henry Chang

References

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Cite This Article
Cao, W., Song, L., Cheng, J., Yi, N., Cai, L., Huang, F., Ho, M. An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration. J. Vis. Exp. (127), e56507, doi:10.3791/56507 (2017).

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