Overexpression וטיהור האדם<em> Cis</em> פרנליטרונפרפרז ב<em> Escherichia coli</em
Summary
פרוטוקול פשוט overexpression וטיהור של קודון אופטימיזציה, CIS- perrenyltransferase אדם, בתנאים שאינם denaturing, מ Escherichia Coli , מתואר, יחד עם assay פעילות אנזימטית. פרוטוקול זה ניתן להכליל לייצור של חלבונים אחרים cis- prenyltransferase בכמות ואיכות מתאים ללימודי מכניסטית.
Abstract
Prenyltransferases (PT) הם קבוצה של אנזימים כי להאיץ שרשרת הארכה של diphosphate allylic באמצעות dophosphate isopentenyl (IPP) באמצעות תגובות עיבוי מרובים. DHDDS (synthase דיפוספט dehydrodolichyl) הוא -PT cis ארוכי שרשרת איקריוטיים (להרכיב קשרים כפולים cis מן תגובת דחיסה) המזרז התארכות שרשרת של דיפוספט farnesyl (FPP, גידול דיפוספט allylic) באמצעות condensations מרובים עם דיפוספט isopentenyl (IPP). DHDDS הוא בעל חשיבות ביו רפואית, כמו מוטציה לא שמרנית (K42E) בתוצאות האנזים ב רטיניטיס pigmentosa , ובסופו של דבר מוביל לעיוורון. לכן, פרוטוקול זה פותח על מנת לרכוש כמויות גדולות של DHDDS מטוהרים, מתאים ללימודי מכניסטית. כאן, השימוש של היתוך חלבון, אופטימיזציה התנאים התרבות אופטימיזציה קודון שימשו כדי לאפשר overexpression וטיהור של DHDDS האדם פעיל מבחינה תפקודית <eM> E. Coli. הפרוטוקול המתואר הוא פשוט, חסכוני זמן חוסך. ההומולוגיה של CIS -PT בין מינים שונים מצביעה על כך שפרוטוקול זה עשוי להיות מיושם גם עבור CIS- eukaryotic אחרים, כמו אלה, כגון אלה המעורבים בסינתזה של גומי טבעי.
Introduction
Prenyltransferases הם קבוצה של אנזימים כי להאיץ שרשרת הארכה של diphosphate allylic באמצעות diphosphate isopentenyl (IPP) באמצעות תגובות עיבוי מרובים 1 , 2 . אנזימים מסוג Z לזרז את ההיווצרות של קשרים כפולים cis מן תגובת הדחיסה, בעוד אנזימי E-סוג מזרזי היווצרות קשר כפול טרנס 3. Cis- perrenyltransferases ( CIS -PT, Z- סוג אנזימים) מסווגים באופן קלאסי על פי אורך שרשרת המוצר שלהם לתוך שרשרת קצר (C 15 ), שרשרת בינונית (C 50-55 ), שרשרת ארוכה (C 70-120 ) 4 . DHDDS (synthase דיפוספט dehydrodolichyl) הוא -PT cis ארוך שרשרת איקריוטיים מזרז התארכות שרשרת של דיפוספט farnesyl (FPP, גידול דיפוספט allylic) באמצעות condensations המרובה עם דיפוספט isopentenyl (IPP) 1, 5 , 6 . התוצאה היא היווצרות של dhydosphate dehydrodolichyl, C 55-100 poliprenyl diphosphate המשמש מבשר עבור dolichylpyrophosphate, המולקולה המוביל glycosyl מעורב N- חלבון glycosylation 1 . בקרב היהודים האשכנזים, מוטציה שאינה שמרנית (K42E) ב- DHDDS גורמת לרטוסניטיס רסיסיבי pigmentosa 7 , 8 . לכן, הפרוטוקול הנוכחי פותח על מנת לרכוש מטוהרים DHDDS מתאים ללימודי מכניסטית.
Escherichia coli נחשב המארח הנוח ביותר וחסכוני עבור ביטוי חלבון רקומביננטי, ולכן הוא גם המארח הנפוץ ביותר. עם זאת, כאשר אחד מנסה heterologously overexpress חלבונים E. coli , חלבון ספציפי שיקולים צריך להיעשות. קבלת מקופל כראוי, פעילE חלבונים רקומביננטי מ E. coli , הוא לא עניין פשוט בשל תכונות שונות של חלבונים שונים. גישות רבות פותחו כדי להתגבר על משוכות אלה. כאן, השימוש של היתוך חלבון, אופטימיזציה התנאים התרבות אופטימיזציה קודון שימשו כדי לאפשר overexpression וטיהור של DHDDS האדם פעיל מבחינה תפקודית E. קולי . ראוי לציין, ניסיון קודם overexpress שמרים cis- PT ללא היתוך חלבון לא הצליח בשל חוסר מסיסות מלאה אפילו בנוכחות של חומר ניקוי 12 . הפרוטוקול המתואר הוא פשוט, חסכוני, זמן חוסך ומאפשר אחד כדי לקבל DHDDS ההכנות מתאים ללימודי מכניסטית. בהינתן ההומולוגיה של CIS -PT בין המינים השונים, אנו מציעים כי פרוטוקול זה עשוי להיות מיושם עבור אחרים cis- eukaryotic גם כן.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן לטיהור של DHDDS תפקודית האדם בתאי coli הוא פשוט ויעיל, המאפשר אחד overexpress ולטהר את החלבון ב 3 – 4 ימים לאחר מבנה מתאים זמין. פרוטוקולים כאלה עבור טיהור חלבון הם בעלי משמעות מיוחדת בהתחשב פריצות דרך ברצף הגנום, אשר סיפקה שפע של מידע לגבי הגנטיקה של מחל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי המרכז למצוינות מחקר של מכון המדעים הישראלי (I-CORE) בביולוגיה תאית מבנית (1775/12) והקרן למדע ישראל מעניקה 1721/16 ו – 2338/16 (YH) ו – 825/14 (DK ). התמיכה של הקרן נכסי פילדס DK הוא מוערך מאוד. עבודה זו בוצעה על ידי אילן אדרי ומיכל גולדנברג בהגשמה חלקית של דרישות התזה של הפקולטה לרפואה ע"ש סאקלר, אוניברסיטת תל-אביב.
Materials
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| TALON-superflow resin | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 desalting column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
| superdex-200 increase 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-Isopentenyl pyrophosphate | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| trans,trans-Farnesyl pyrophosphate | Sigma | 44270-10MG |
References
- Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
- Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
- Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).
- Imperiali, B., O’Connor, S. E. Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure. Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).
- Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis. J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).
- Adair, W. L., Cafmeyer, N. Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).
- Zelinger, L., et al. A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews. Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).
- Zuchner, S., et al. Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
- Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages. Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).
- Middelberg, A. P. Process-scale disruption of microorganisms. Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).
- Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).
- Sachyani, D., et al. Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin. Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).
- Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels. Nat Commun. 2, 457 (2011).
- Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).
- Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton. J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).
- Guo, R. T., et al. Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis. J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).
- Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. A vision for the future of genomics research. Nature. 422 (6934), 835-847 (2003).
- Freeze, H. H. Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge. J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).
- LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
- Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Front Microbiol. 5, 21 (2014).
- Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55 (1), 65-72 (2011).
