Cette publication décrit la fabrication d’un dispositif d’orgue-on-chip avec électrodes intégrées pour la quantification directe de résistance électrique transendothéliale (TEER). Pour la validation, la barrière hémato – encéphalique a été imitée à l’intérieur de ce dispositif microfluidique et sa fonction de barrière a été suivie. Les méthodes présentées pour l’intégration de l’électrode et quantification directe de TEER sont généralement applicables.
Organes-on-Chip, in vitro modèles mettant en cause la culture de tissus (humains) à l’intérieur de dispositifs microfluidiques, sont rapidement émergentes et la promesse de fournir utiles recherche outils pour étudier la maladie et la santé humaine. Afin de caractériser la fonction de barrière de couches de cellules cultivées à l’intérieur de l’orgue-sur-puce, souvent transendothéliale ou transépithélial résistance électrique (TEER) est mesurée. À cette fin, les électrodes sont généralement intégrés dans la puce par des méthodes de micro-usinage pour fournir des mesures plus stables que celui qui est obtenu avec l’insertion manuelle des électrodes dans les criques de la puce. Cependant, ces électrodes fréquemment entravent une inspection visuelle de la couche de cellules étudiées ou exigent cleanroom coûteux processus de fabrication. Pour surmonter ces limites, l’appareil décrit ici contient quatre électrodes facilement intégrés qui sont placées et fixées à l’extérieur de la zone de culture, permettant une inspection visuelle. En utilisant ces quatre électrodes de que la résistance des six voies de mesure peut être quantifiée, d’où la TEER peut être directement isolée, indépendante de la résistance des microcanaux remplis de milieu de culture. La barrière hémato – encéphalique ont été répliquée dans cet appareil et sa TEER a été suivie pour montrer l’applicabilité de l’appareil. Cette puce, les électrodes intégrées et la méthode de détermination de TEER sont généralement applicables dans les organes-on-Chip, aussi bien pour imiter les autres organes ou être intégré dans les systèmes existants d’orgue-on-chip.
Organes-on-Chip est rapidement en train de devenir un nouveau et prometteur classe de in vitro des modèles de tissus. 1 dans ces modèles, les cellules sont cultivées à l’intérieur de dispositifs microfluidiques qui sont conçus de telle manière qu’ils imitent le microenvironnement physiologique de ces cellules. 1 , 2 cela se traduit par un comportement physiologique ou pathologique plus réaliste de ces cellules que peut-on attendre de classiques in vitro des modèles de conception simple et de la fonction de base. 3 , 5 , 6 en outre, organes-on-Chip fournit un environnement plus contrôlable que les modèles in vivo et peut intégrer des tissus sains et malades d’origine humaine à reproduire fidèlement la physiologie humaine et pathologie. Les progrès récemment résumées dans l’apparition de sang – cerveau obstacles sur les puces (GFGS-on-Chip) montrent que le domaine évolue rapidement vers l’avant. 7
Un autre avantage des organes-on-Chip, c’est qu’ils permettent une surveillance en temps réel et permanente des tissus cultivés à l’intérieur de l’appareil par microscopie, des analyses biochimiques en ligne et des capteurs intégrés. 1 , 2 par exemple, mesurer la résistance électrique transendothéliale ou transépithélial (TEER) est une méthode puissante pour la surveillance non invasive de la mise au point et la perturbation formant barrière des tissus. 8 , 9 , 10 TEER est la résistance électrique à travers une barrière cellulaire et est donc indicative de l’intégrité de la barrière et la perméabilité. 10 dans les organes-on-Chip, barrières cellulaires sont généralement cultivées sur une membrane qui sépare les deux canaux fluidiques, représentant l’apicale et basolatérale compartiments de ce tissu de barrière. Ces jetons, mesures de TEER peuvent se dérouler idéalement avec des électrodes insérées dans les entrées et sorties des deux canaux. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 Toutefois, insertion manuelle et la réinsertion des électrodes peuvent facilement entraîner dans erreurs de placement et donc dans les variations de la résistance mesurée comme par exemple les différences dans la résistance des chemins plus ou moins par le biais de microcanaux sont significatives par rapport à la résistance de barrière de cellule. 16 pour éliminer les erreurs de la réinsertion, dispositifs avec électrodes intégrées ont été proposées. Cependant, la plupart de ces électrodes intégrées bloquent la vue lors de l’inspection les vitroplants17,18,19,20,21 et/ou exigent spécialisés salle blanche des processus de fabrication. 17 , 22
Le dispositif de l’orgue-on-chip décrit dans cette publication, tout d’abord appliquée dans une publication antérieure,16 combine la stabilité des électrodes intégrées avec visibilité sur la couche de cellules mesurées et la fabrication facile. La conception et la fabrication de cette puce est représenté dans la Figure 1. En bref, cet appareil comprend deux parties polydiméthylsiloxane (PDMS) avec empreintes de canal qui sont collées ensemble sans fuite avec une membrane en polycarbonate avec 0,4 µm pores entre les deux. Quatre électrodes de fil de platine sont insérés et fixés en place avec un photodurcissable colle bien à l’extérieur de la zone de culture. Toutes ces étapes de fabrication peuvent être effectuées avec le matériel de laboratoire générales, sans la nécessité d’un environnement de salle blanche. En outre, six mesures d’impédance peuvent être faites à l’aide de ces quatre électrodes, permettant ainsi à isolement direct de la mesure TEER, indépendante de la résistance des microcanaux menant à la section efficace et afin de minimiser l’influence de variations du système tels que (re) erreurs d’insertion non biologiques. 16
Pour montrer l’applicabilité de ce dispositif et les mesures directes de TEER, que la barrière sang – encéphalique (BHE) a été transposée dans cette puce. Cette barrière biologique est constitué de cellules endothéliales spécialisés et réglemente le transport entre le sang et le cerveau pour fournir l’homéostasie du cerveau. 23 , 24 pour imiter le BBB, le canal du haut du dispositif microfluidique était bordé de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales humaines de la lignée hCMEC/D3 (aimablement fourni par le Dr p.-O. Couraud, INSERM, Paris, France). 25 la méthode présentée est, cependant, plus généralement applicable à n’importe quel dispositif d’orgue-on-chip avec deux compartiments, permettant la détermination directe de TEER utilisant facilement intégrée des électrodes.
Dans ce manuscrit, tout d’abord le procédé de fabrication de l’appareil de l’orgue-on-chip avec électrodes intégrées est décrite. Suivant, la procédure semis et la culture de cellules endothéliales du cerveau à l’intérieur de l’appareil est expliquée, ainsi que les mesures de TEER sur puce. Dans la section résultats, mesures représentatives de TEER sont montrés et traitement des données est clarifiée. Enfin, la fonction barrière de la BBB-on-chip, surveillée pendant 3 jours, est présentée, montrant l’applicabilité de l’appareil présenté et les méthodes de surveillance TEER.
Dans ce manuscrit, le génie d’un dispositif d’orgue-on-chip et la détermination directe de la résistance électrique transendothéliale (TEER) d’une barrière cellulaire cultivée dans l’appareil ont été présentées. La méthode présentée d’intégrer les électrodes sans équipement de salle blanche et la détermination de TEER directe à l’aide de quatre électrodes s’applique à tout appareil d’orgue-on-chip avec deux compartiments de la microfluidique. L’agencement de la puce et la géométrie peuvent être adaptés pour répondre aux exigences des expériences envisagés, tant que les quatre électrodes sont séparées en deux compartiments. Les quatre électrodes peuvent même être idéalement insérés dans les criques de puces existantes, autant qu’ils sont fixés en place pendant la durée des six mesures. La méthode de collage sans fuite peut être optimisée pour différentes membranes et géométries de canal en changeant le ratio PDMS/toluène. Une teneur plus élevée en toluène entraîne un amincissement de la couche spin-enduit de mortier26 et peut être plus appropriée pour les canaux moins profondes et plus étroite dans les régions PDMS. Une basse toluène contenu se traduisent par un mortier plus épaisse couche26 et peut être plus approprié encadrer des membranes plus épais entre les pièces PDMS.
Comme peut être vu dans les spectres d’impédance schématique en Figure 2 a et des spectres expérimentaux dans Figure 2E et 2F, les mesures d’impédance sont influencés par la capacité de la double couche à l’interface électrode-moyen. En raison de l’exiguïté des électrodes à l’intérieur les microcanaux, la capacité de la double couche peut dominer le plateau résistif de la barrière cellulaire dans les spectres d’impédance, ce qui complique la quantification de la TEER. Pour y remédier, les électrodes peuvent être insérés dans les chaînes de culture avant la fixation. Cela augmentera la surface de l’électrode exposé au milieu de culture et que la capacité de la couche double augmentera aussi bien. Cela se traduit par un changement de la pente capacitif à des fréquences plus basses, alors que le plateau résistif de la barrière cellulaire peut être plus facilement reconnue et quantifiée. Bien que la résistance de la voie mesurée entre deux électrodes deviendra plus petite, cela n’influencera pas la quantification TEER suivant la méthode présentée.
Lorsque vous mesurez à travers la barrière cellulaire, il est possible que le plateau supplémentaire résistif ne saurait être admise. Cela peut être le résultat d’un lien fluidique entre ces deux canaux, par exemple, si la membrane est mal délimitée par le mortier, menant à un chemin d’accès mesurée autour de la barrière cellulaire. En outre, il peut y avoir de raccordement électrique à l’extérieur de la puce si les électrodes sont reliées par une goutte de milieu de culture. Ceci est généralement associé à une impédance mesurée inférieure et peut être résolu en supprimant ce pont du milieu de culture. Enfin, si il n’y a aucun plateau résistif et l’impédance mesurée est des ordres de grandeur plus élevés que prévu, il peut y avoir une mauvaise connexion du câblage électrique ou à la source d’alimentation.
À l’avenir, la pertinence physiologique de la BBB-on-chip actuel peut être augmentée en exposant les cellules endothéliales pour shear stress à des niveaux physiologiques, ce qui est signalé à promouvoir BBB différenciation et augmentation barrière étanchéité et est difficile à réaliser dans les modèles classiques en vitro . 29 en outre, le canal du bas de l’appareil présenté dispose d’un logement adapté pour encéphales de cellules pour être cultivées conjointement avec l’endothélium. Cela devrait aussi accroître la fonction barrière et permet également l’étude des interactions complexes entre les types de cellules concernées dans des conditions pathologiques. 29
En conclusion, le dispositif d’orgue-on-chip décrit dans cette publication peut être fabriqué à l’aide de matériel de laboratoire standard et est conçue pour permettre des mesures directes de TEER, à l’aide de quatre électrodes intégrées qui ne font pas obstacle à une inspection visuelle de la cellule étudiée couche. L’applicabilité de ce dispositif dans le domaine des organes-on-Chip a été démontrée en imitant la BHE dans cette puce et en surveillant la TEER durant la période de culture. Une foule d’autres organes (barrière) peut être imitée en incluant d’autres types de cellules pertinentes dans cette puce. En outre, la méthode de mesure TEER peut être facilement appliquée dans d’autres deux dispositifs d’orgue-on-chip axée sur le compartiment pour en arriver à des valeurs TEER reproductibles et significatifs qui peuvent être comparées sur les dispositifs et systèmes.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions sincèrement Johan Bomer pour la fabrication du moule et Mathijs Bronkhorst pour des discussions fructueuses et aide à la représentation des données.
Cette recherche a été financée par : SRO Biomedical Microdevices de L.I. Segerink, MIRA Institut de génie biomédical et des techniques de médecine, Université de Twente ; SRO organes-on-Chip de A.D. van der Meer, MIRA Institut de génie biomédical et des techniques de médecine, Université de Twente ; et VESCEL, ERC Advanced Grant à A. van den Berg (subvention no 669768).
Materials | |||
Polydimethylsiloxane (PDMS) base agent and curing agent: Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | 1673921 | |
Scotch Magic tape | 3M | ||
Biopsy punch, 1.0 mm diameter | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
Polycarbonate membrane, 0.4 µm pore size | Corning | 3401 | Cut from Transwell culture inserts |
Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
Platinum wire, 200 µm diameter | Alfa Aesar | 10287 | |
UV-curable adhesive: Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
Epoxy adhesive: Loctite M-31 CL Hysol | Henkel | 30673 | |
hCMEC/D3 cells | Human cerebral microvascular endothelial cell line, kindly provided by Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, France | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
Human plasma fibronectin, 20 µg/ml | Gibco | 33016015 | |
Endothelial growth medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots |
Trypsin-EDTA, 0.05% | Gibco | 15400-054 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Oven | Binder | 9010-0190 | |
Spin coater: Spin 150 | Polos | SPIN150-NPP | |
UV light source, 365 nm for 5 s at 350 mW/cm2 | Manufactured in-house | ||
Centrifuge: Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | ||
Incubator | Binder | CB E2 150 | |
Boxense | LocSense | Lock-in amplifier with probe cable circuit, specialized for on-chip TEER measurements |