ويصف هذا المنشور تصنيع جهاز الجهاز على رقاقة مع أقطاب متكاملة للتحديد الكمي المباشر للمقاومة الكهربائية ترانسيندوثيليال (طير). للتحقق من الصحة، كان يحاكي حاجز الدم في الدماغ داخل هذا الجهاز موائع جزيئية ورصد وظيفتها الحاجز. عرض طرق التكامل الكهربائي ومباشرة طير الكمي قابلة للتطبيق عموما.
الأجهزة على الرقائق، في المختبر النماذج التي تنطوي على ثقافة الأنسجة (الإنسان) داخل أجهزة موائع جزيئية، هي سرعة الناشئة، ووعد بتقديم مفيدة أدوات البحث لدراسة صحة الإنسان والمرض. لتوصيف وظيفة الحاجز من طبقات الخلايا المزروعة داخل الجهاز في رقاقة الأجهزة، يقاس غالباً ما ترانسيندوثيليال أو ترانسيبيثيليال المقاومة الكهربائية (طير). وتحقيقا لهذه الغاية، تتكامل أقطاب عادة الرقاقة بأساليب ميكروماتشينينج لتوفير قياسات أكثر استقرارا مما تم تحقيقه مع الإدراج اليدوي لأقطاب في مداخل للرقاقة. بيد هذه الأقطاب كثيرا ما تعرقل التفتيش البصري طبقة خلية درس أو تتطلب عمليات مكلفة تنظيم لتلفيق. للتغلب على هذه القيود، يحتوي الجهاز الموضح هنا على أربعة أقطاب المتكاملة بسهولة التي يتم وضعها وثابتة خارج منطقة الثقافة، مما يجعل من الممكن الفحص البصري. باستخدام هذه أربعة أقطاب المقاومة من ستة قياس مسارات يمكن قياسها كمياً، منه طير يمكن أن تكون مباشرة معزولة، مستقلة عن مقاومة ميكروتشانيلس مليئة بالثقافة المتوسطة. حاجز الدم في الدماغ تم تكرارها في هذا الجهاز وتم رصد لها طير لإظهار مدى انطباق الجهاز. هذه الرقاقة، واقطاب كهربائية متكاملة وطريقة تصميم طير قابلة للتطبيق عموما في الأجهزة-على-رقائق، سواء لتقليد الأجهزة الأخرى أو لإدراجها في القائمة الجهاز على رقاقة النظم.
سرعة الأجهزة على رقائق الناشئة باعتبارها جديدة وواعدة فئة في المختبر نماذج الأنسجة. 1 في هذه النماذج، تستزرع خلايا داخل أجهزة موائع جزيئية التي صممت بطريقة أنها تحاكي المكروية الفسيولوجية لتلك الخلايا. 1 , 2 هذه النتائج في السلوك الفسيولوجية أو المرضية أكثر واقعية من تلك الخلايا مما يمكن توقعه من النماذج التقليدية في المختبر لتصميم بسيط ووظيفتها الأساسية. 3 , 5 , 6 بالإضافة إلى ذلك، أجهزة على رقائق توفير بيئة يمكن السيطرة عليها أفضل من النماذج في فيفو ويمكن إدماج الأنسجة السليمة والمريضة سواء من أصل البشرية لتكرار إخلاص البشرية علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض. التقدم مؤخرا ملخصة في وضع حواجز الدماغ – الدم على رقائق (ببس على رقائق) تظهر أن الحقل يتحرك بسرعة إلى الأمام. 7
وهناك ميزة أخرى للأجهزة على رقائق أنها تتيح الرصد في الوقت الحقيقي والمستمر للأنسجة المزروعة داخل الجهاز بالفحص المجهري والتحاليل البيوكيميائية على شبكة الإنترنت وأجهزة الاستشعار المتكاملة. 1 , 2 على سبيل المثال، قياس المقاومة الكهربائية ترانسيندوثيليال أو ترانسيبيثيليال (طير) وسيلة قوية لرصد تطور غير إينفاسيفيلي، وتعطل تشكيل حاجز الأنسجة. 8 , 9 , 10 طير المقاومة الكهربائية عبر حاجز خلوية وهو لذلك يدل على سلامة الحاجز والنفاذيه. 10 في الأجهزة على الرقائق، الحواجز الخلوية عموما تستزرع في غشاء الذي يفصل بين اثنين من قنوات فلويديك، تمثل في قمي ومقصورات باسولاتيرال لأن النسيج الحاجز. في هذه الرقائق، يمكن إجراء قياسات طير مريح مع أقطاب إدراجها في مداخل ومنافذ للقناتين. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 بيد الإدراج اليدوي وإعادة الإدماج من أقطاب كهربائية يمكن بسهولة يؤدي أخطاء التنسيب وهكذا في الاختلافات في المقاومة المقاسة مثل الاختلافات في المقاومة لمسارات أطول أو أقصر من خلال ميكروتشانيلس تتم مقارنة هامة لمقاومة الجدار خلية. 16 للقضاء على أخطاء إعادة الإدماج، الأجهزة مع أقطاب المتكاملة قد اقترحت. ومع ذلك، معظم هذه الأقطاب المتكاملة كتلة الرأي عند تفتيش زراعة الأنسجة17،18،19،،من2021 و/أو تتطلب المتخصصة تنظيم عمليات التصنيع. 17 , 22
الجهاز الجهاز على رقاقة الوارد وصفها في هذه النشرة، التي تطبق أولاً في منشور سابق،16 يجمع بين استقرار أقطاب متكاملة مع بروز طبقة الخلية المقاسة وسهلة التصنيع. تصميم وتصنيع هذه الرقاقة هو مبين في الشكل 1. باختصار، هذا الجهاز يتكون من جزأين بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) مع بصمات القناة التي يتم المستعبدين معا خالية من التسرب مع غشاء البولي مع 0.4 ميكرومتر المسام بين بين. يتم إدراج أربعة أسلاك البلاتين الأقطاب وثابتة في مكانها مع فوتوكورابل لاصقة جيدا خارج مجال الثقافة. ويمكن إجراء كل هذه الخطوات تلفيق مع معدات المختبرات العامة، دون الحاجة إلى وجود بيئة تنظيم. علاوة على ذلك، يمكن أن يتم ستة معاوقة القياسات باستخدام هذه الأقطاب الأربعة، مما يسمح لعزله مباشرة من طير المقاسة، مستقلة عن مقاومة ميكروتشانيلس المؤدية إلى المقطع العرضي، وهكذا التقليل من التأثير غير البيولوجية الاختلافات في النظام مثل (إعادة) أخطاء الإدراج. 16
لإظهار مدى انطباق هذا الجهاز والقياسات طير مباشرة، تم نسخ حاجز الدم في الدماغ (بي بي بي) في هذه الشريحة. هذا الحاجز البيولوجي يتكون من خلايا بطانية المتخصصة وينظم النقل بين الدم والدماغ لتوفير التوازن في الدماغ. 23 , 24 لتقليد BBB، القناة أعلى الجهاز موائع جزيئية قد اصطف مع البشرية خلايا بطانية microvascular الدماغي من خط خلية هكميك/D3 (يرجى تقديم الدكتور ص. ب كورو، INSERM، باريس، فرنسا). أسلوب عرضها 25 ، بيد أعم تنطبق على أي جهاز الجهاز على رقاقة مع مقصورات اثنين، مما يتيح تحديد طير مباشرة بسهولة باستخدام المتكاملة أقطاب.
في هذه المخطوطة، أولاً يتم وصف عملية تصنيع الجهاز رقاقة على الجهاز مع أقطاب متكاملة. التالي، والبذر الداخلي والثقافة من خلايا الدماغ بطانية داخل الجهاز هو أوضح، فضلا عن القياسات طير على شريحة. في المقطع “النتائج”، تظهر الممثلة طير القياسات ويتم توضيح معالجة البيانات. وأخيراً، يرد وظيفة الحاجز BBB-على شريحة، رصد خلال 3 أيام،، إظهار انطباق الأجهزة المقدمة وأساليب لرصد طير.
وعرضت في هذه المخطوطة، هندسة جهاز الجهاز على رقاقة وعزم المقاومة الكهربائية ترانسيندوثيليال (طير) حاجز خلوية المزروع في الجهاز مباشرة. طريقة عرض دمج أقطاب دون تنظيم المعدات وتصميم طير مباشرة باستخدام أربعة أقطاب تنطبق على أي جهاز الجهاز على رقاقة مع اثنين من المقصورات موائع جزيئية. تخطيط شريحة والهندسة يمكن تكييفها لتناسب متطلبات التجارب المتوخاة، طالما يتم فصل أربعة أقطاب كهربائية في مقصورات اثنين. أربعة أقطاب كهربائية يمكن حتى مريح إدراجها في مداخل رقائق القائمة، شريطة أن تركز اهتمامها في مكان لمدة ستة القياسات. يمكن أن يكون الأمثل طريقة الربط خالية من التسرب للأغشية المختلفة وهندستها القناة بتغيير نسبة PDMS/التولوين. محتوى تولوين أعلى النتائج في طبقة أرق المغلفة بزيادة ونقصان من الهاون26 وقد يكون أكثر ملاءمة لقنوات أضيق نطاقا وأقل عمقاً في أجزاء PDMS. أقل نتائج محتوى تولوين في قذيفة هاون سمكا طبقة26 وقد يكون أكثر ملاءمة لإحاطة الأغشية سمكا بين أجزاء PDMS.
كما يمكن أن يرى في الأطياف معاوقة التخطيطي في الشكل 2 ألف والأطياف تجريبي في الشكل 2E و 2 واو، تتأثر القياسات معاوقة السعة طبقة مزدوجة في واجهة القطب والمتوسطة. نظراً لصغر حجم الأقطاب داخل ميكروتشانيلس، يمكن أن تسيطر على السعة طبقة مزدوجة على الهضبة مقاوم للجدار الخلوي في أطياف مقاومة، تعقيد التقدير الكمي لطير. للتغلب على ذلك، يمكن إدراج الأقطاب مزيد من قنوات الثقافة قبل التثبيت. سيؤدي هذا إلى زيادة المساحة السطحية لمسرى يتعرض إلى متوسط الثقافة، ومع ذلك سيتم زيادة السعة طبقة مزدوجة كذلك. ينتج عن هذا تحول المنحدر بالسعة لترددات أقل، حتى تكون الهضبة مقاوم للجدار الخلوي كمياً ومعترف بها بسهولة أكثر. على الرغم من أن مقاومة طريق قياس بين قطبين سيصبح أصغر، هذا لن تؤثر على التقدير الكمي طير اتباع أسلوب عرضها.
أثناء قياس عن طريق الجدار الخلوي، فمن الممكن أن الهضبة مقاوم إضافية لا يمكن الاعتراف بها. وهذا يمكن أن يكون نتيجة لاتصال فلويديك بين اثنين من القنوات، على سبيل المثال إذا كان الغشاء هو ضعيف محاطة بقذائف الهاون، مما يؤدي إلى مسار قياس حول الجدار الخلوي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن سد الكهربائية خارج الرقاقة إذا أقطاب كهربائية متصلة بواسطة معالجة تجميعية للثقافة المتوسطة. هذا هو عموما جنبا إلى جنب مع مقاومة المقاسة أقل ويمكن حلها عن طريق إزالة هذا الجسر من الثقافة المتوسطة. وأخيراً، إذا كان هناك لا هضبة مقاوم ومقاومة المقاسة أوامر من حجم أكبر من المتوقع، قد يكون هناك ارتباط وثيق في الأسلاك الكهربائية أو في مصدر الطاقة.
في المستقبل، يمكن زيادة أهمية فسيولوجية BBB الحالية على الرقاقة بتعريض خلايا بطانية للإجهاد على المستويات الفسيولوجية، التي يقال أن تعزيز BBB التمايز وزيادة حاجز ضيق ومن الصعب تحقيق إمالة في النماذج التقليدية في المختبر . 29 بالإضافة إلى ذلك، توفر القناة السفلي لجهاز عرض حجرة مناسبة للخلايا المستمدة من الدماغ ليكون مثقف يشترك مع البطانة. هذا ومن المتوقع أيضا زيادة وظيفة الحاجز ويتيح أيضا دراسة التفاعلات المعقدة بين أنواع الخلايا ذات الصلة في ظل الظروف المرضية. 29
وفي الختام، يمكن أن تكون ملفقة باستخدام معدات المختبرات القياسية الجهاز الجهاز على رقاقة الموصوفة في هذا المنشور ويرد لتوفير قياسات طير مباشرة باستخدام أربعة أقطاب المتكاملة التي لا تعوق التفتيش البصري لدرس الخلية طبقة. وتجلى انطباق هذا الجهاز في مجال الرقائق في أجهزة محاكاة BBB في هذه الشريحة والرصد طير أثناء فترة الثقافة. يمكن أن تحاكي مجموعة من الأجهزة الأخرى (الحاجز) بها بما في ذلك أنواع الخلايا ذات الصلة الأخرى في هذه الشريحة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن بسهولة تطبيق طريقة لقياس طير في الأخرى المستندة إلى حجرة الجهاز على رقاقة جهازين للتوصل إلى قيم طير استنساخه والهادفة التي يمكن مقارنتها عبر الأجهزة وأنظمة.
The authors have nothing to disclose.
نعترف بامتنان يوهان Bomer لتصنيع العفن وارمسكور ماتيس لمناقشات مثمرة والمساعدة مع تمثيل البيانات.
ومولت هذه البحوث: المؤسسة الطبية ميكروديفيسيس للي سيجيرينك، ميرا معهد للهندسة الطبية والتقنية الطب، جامعة توينتي؛ المؤسسة الأجهزة-على-رقائق ميلادي فإن دير مير، ميرا معهد للهندسة الطبية والتقنية الطب، جامعة توينتي؛ وفيسيل، “منسق الإغاثة الطارئة المتقدمة منحة” أ فإن دن بيرغ (المنحة رقم 669768).
Materials | |||
Polydimethylsiloxane (PDMS) base agent and curing agent: Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | 1673921 | |
Scotch Magic tape | 3M | ||
Biopsy punch, 1.0 mm diameter | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
Polycarbonate membrane, 0.4 µm pore size | Corning | 3401 | Cut from Transwell culture inserts |
Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
Platinum wire, 200 µm diameter | Alfa Aesar | 10287 | |
UV-curable adhesive: Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
Epoxy adhesive: Loctite M-31 CL Hysol | Henkel | 30673 | |
hCMEC/D3 cells | Human cerebral microvascular endothelial cell line, kindly provided by Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, France | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
Human plasma fibronectin, 20 µg/ml | Gibco | 33016015 | |
Endothelial growth medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots |
Trypsin-EDTA, 0.05% | Gibco | 15400-054 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Oven | Binder | 9010-0190 | |
Spin coater: Spin 150 | Polos | SPIN150-NPP | |
UV light source, 365 nm for 5 s at 350 mW/cm2 | Manufactured in-house | ||
Centrifuge: Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | ||
Incubator | Binder | CB E2 150 | |
Boxense | LocSense | Lock-in amplifier with probe cable circuit, specialized for on-chip TEER measurements |