Summary
Hier beschrijven we een fluorimetrische cel-vrije biochemische bepaling voor bepaling van de HDL-lipide peroxidatie. Deze snelle en reproduceerbare kwantitatieve analyse kan worden gebruikt om te bepalen van HDL functie in grootschalige studies en kan bijdragen aan ons begrip van HDL functie in ziekten bij de mens.
Abstract
Lage high-density lipoproteïne (HDL-C) cholesterolgehalte zijn een van de meest krachtige onafhankelijke negatieve voorspellers van atherosclerotische cardiovasculaire ziekte (CVD). De structuur en functie van HDL in plaats van HDL-C kunnen nauwkeuriger voorspellen atherosclerose. Verschillende HDL eiwitten en lipiden compositorische wijzigingen die afbreuk doen aan HDL functie optreden in inflammatoire toestanden zoals atherosclerose. HDL functie wordt meestal bepaald door cellen gebaseerde testen zoals cholesterol efflux assay maar deze testen hebben talrijke nadelen gebrek aan standaardisatie. Cel-gratis testen kunnen krachtiger maatregelen van HDL functie ten opzichte van cel-gebaseerde testen geven. HDL oxidatie schaadt HDL functie. HDL is een belangrijke rol in de peroxide lipidentransport en hoge hoeveelheid lipide-peroxiden is gerelateerd aan de abnormale functie van de HDL. Lipide-sonde interacties moeten worden beschouwd wanneer het interpreteren van de resultaten van de niet-enzymatische fluorescentie testen voor het meten van de lipide oxidatieve staat. Dit motiveerde ons een cel-vrije biochemische enzymatische methode voor de beoordeling van HDL lipide peroxidegehalte (HDLox) dat aan HDL dysfunctie bijdraagt te ontwikkelen. Deze methode is gebaseerd op het enzym horseradish peroxidase (HRP) en de fluorescerende Amplex rood dat (zonder cholesterol oxidase) de lipide peroxidegehalte per mg HDL-C. kwantificeren kan Hier is een protocol describedfor bepaling van de HDL-lipide peroxidatie waarbij de fluorescerende reagens gebruikt. Assay variabiliteit kan worden verminderd door strikte standaardisatie van experimentele omstandigheden. Hogere HDLox waarden worden geassocieerd met verlaagde HDL anti-oxidant functie. De uitlezing van deze bepaling wordt geassocieerd met uitlezingen van gevalideerde cel-gebaseerde tests, surrogaat maatregelen van hart-en vaatziekten, systemische ontstekingen, immuun disfunctie en bijbehorende risico van cardiovasculaire en metabole fenotypen. Deze technische aanpak is een robuuste methode te beoordelen van HDL functie in ziekten bij de mens waar systemische ontstekingen en oxidatieve stress geoxideerde vetten een belangrijke rol (zoals atherosclerose hebben).
Introduction
Atherosclerotische cardiovasculaire ziekte (CVD) is de belangrijkste oorzaak voor overlijden wereldwijd1,2. Epidemiologische studies hebben aangetoond dat lage niveaus van high-density lipoproteïne (HDL) cholesterol over het algemeen omgekeerd geassocieerd met het risico voor de ontwikkeling van atherosclerose1,2 zijn. Hoewel verscheidene studies een atheroprotective rol voor HDL1,2 ondersteunen, is het mechanisme waarmee HDL de initiatie en de vooruitgang van atherosclerose verzwakt complexe 3,4. Dus is er gesuggereerd dat de complexe structuur en functie van HDL in plaats van absolute niveau atherosclerose 5,6,7,8nauwkeuriger kunnen voorspellen. Verschillende HDL eiwitten en lipiden compositorische wijzigingen die afbreuk doen aan HDL functie optreden in inflammatoire toestanden zoals atherosclerose. Deze i) verminderen de cholesterol efflux potentiële 9, ii) afname van de anti-inflammatoire en verhoging van de HDL-geassocieerde pro-inflammatoire eiwitten 6,7, iii) daling antioxidant factor niveaus en activiteit en HDLs mogelijkheid voor de remming van de oxidatie van Low Density lipoproteïne (LDLox)10 en iv) verhogen lipide butylhydroperoxide inhoud en redox activiteit (HDLox)9,11. Robuuste testen die evalueren van de functies van de pleotropic van HDL (zoals cholesterol efflux, antioxidant functie) kunnen aanvulling bepaling van HDL-HDL-C in de kliniek.
HDL functie wordt meestal beoordeeld door cel-gebaseerde methoden zoals de cholesterol efflux assay8,12,13,14. Deze methoden hebben grote beperkingen, met inbegrip van aanzienlijke heterogeniteit met betrekking tot de soorten cellen gebruikt, soort uitlezing gemeld, gebrek aan standaardisatie en storende effecten van triglyceriden 7,15. Deze nadelen opleveren moeilijkheden voor grote klinische studies16. Cel-gratis testen kunnen krachtiger maatregelen van HDL functie ten opzichte van cel-gebaseerde testen geven. De cholesterol efflux is een van de belangrijkste functies van HDL hebt, maar het kan alleen worden bepaald door de cel-gebaseerde testen. Andere benaderingen om HDL functie zoals proteomics17,18,19,20,21,22,23, 24 en cel-gebaseerde monocyt chemotaxis vitrotests van HDL functie 17,22,25 niet zijn gestandaardiseerd en kan niet worden gebruikt in grootschalige menselijke studies.
HDL is een belangrijke antioxidant atheroprotective effect5,6,7,8. De antioxidant functie van HDL is in aanwezigheid van LDL in vorige cel gratis fluorimetrische analyses 26vastgesteld. Deze biochemische fluorimetrische methoden van HDL anti-oxidant functie werden oorspronkelijk ontwikkeld door Mohamad Navab en Alan Fogelman en hun collega's-26. Hoewel veel menselijke studies deze methoden gebruikt hebben om te bepalen van HDL functie 17,18,19,20,21,22,23 ,24, lipide (HDL)-lipide (LDL) en lipide-fluorescerende interacties kunnen reproduceerbaarheid van deze cel gratis niet-enzymatische biochemische tests van HDL functie27,28beperken.
Recente interesse heeft gericht op de functionele gevolgen van HDL oxidatie die is het resultaat van oxidatie van lipiden en eiwitten binnen HDL 27,29,30. Voorafgaande studies hebben aangetoond dat oxidatie van HDL schaadt HDL functie 27,29,30. HDL is een belangrijke rol in de peroxide lipidentransport en hoge hoeveelheid lipide-peroxiden is gerelateerd aan de abnormale functie van de HDL. Dus kan HDL lipide peroxidegehalte worden gebruikt om te bepalen van HDL functie 9,17,20,31 en gezien de bekende beperkingen van voorafgaande tests van HDL functie7, 15,27,32, ontwikkelden we een alternatieve fluorimetrische methode HDL lipide peroxidegehalte (HDLox) 32 kwantificeert. Deze methode is gebaseerd op het enzym horseradish peroxidase (HRP) en de fluorescerende Amplex rood dat de lipide peroxidegehalte per HDL-C 32mg (zonder cholesterol oxidase) kunnen kwantificeren. De biochemische principe van de test is afgebeeld in Figuur 1. We hebben aangetoond dat deze fluorescentie gebaseerde benadering niet over de beperkingen van de voorafgaande HDL functie tests27,28 beschikt. Deze bepaling is verder verfijnd en gestandaardiseerd in ons laboratorium, zodat het op betrouwbare wijze kan worden gebruikt in grootschalige menselijke studies zelfs met cryopreserved plasma 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. de uitlezing van deze bepaling wordt geassocieerd met uitlezingen van gevalideerde cel-gebaseerde tests, surrogaat maatregelen van hart-en vaatziekten, systemische ontsteking, immuun disfunctie en bijbehorende risico van cardiovasculaire en metabole fenotypes 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. hier, beschrijven we deze eenvoudige, maar robuuste methode voor het meten van HDL lipide peroxidegehalte (HDLox). Deze test kan worden gebruikt als een instrument om belangrijke onderzoeksvragen met betrekking tot de rol van HDL functie in ziekten bij de mens te beantwoorden waar systemische ontstekingen en oxidatieve stress geoxideerde vetten hebben een belangrijke rol (zoals atherosclerose)32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle experimenten met behulp van de menselijke biologische monsters werden uitgevoerd met goedkeuring van de ethiek aan de Universiteit van California Los Angeles, Los Angeles en het Comité van de menselijke ethiek van Alfred Hospital, Melbourne.
Opmerking: er zijn vele variaties van de fluorescerende HDL functie Assay (zie discussie) 32. Hieronder beschrijven we het protocol dat de meest consistente en reproduceerbare resultaten oplevert. Een overzicht van de bepaling is afgebeeld in Figuur 2.
1. verwerking van het specimen
- Gebruik verse, niet-hemolyzed serum (kan worden geïnd in serum scheidingsteken buizen) of citraat plasma verkregen na 12-14 uur vasten. Als met behulp van cryopreserved monsters, omvatten passende controlemaatregelen zoals beschreven in dit Protocol.
2. Dag 0-voorbereiding voor de assay
- voorbereiden werken lay-out van het experiment met de juiste besturingselementen, monsters en repliceert. Elk monster ten minste in triplicates uitgevoerd. Een lay-out goed vertegenwoordiger 96 is afgebeeld in Figuur 3.
- Berekenen alle volumes van de reagentia die zal worden gebruikt voor de bepaling op basis van aantal monsters en replicaten.
Opmerking: Een extra 10% volumes opnemen in elk bestand werkend om ervoor te zorgen dat er genoeg volume voor elke reagens voor de specifieke experiment is. - Alle benodigde buizen voor alle verschillende stappen van de assay BV voor de scheiding van HDL, meting van de HDL-C (optioneel) en het fluorochromeassay label.
3. Dag 1-voorbereiding van de controles
- voorbereiding van studie-specifieke gegroepeerde besturingselement
- maken een controlemonster van gebundelde plasma of serum van alle studie monsters. Als 20 voorbeelden uitvoeren in elke plaat in drievoud, combineren 10 µL van elk monster in een besturingselement 200 µL gebundeld. Een aparte hoeveelheid van deze gebundelde controle geven het klinisch laboratorium de HDL-C waarde van dit besturingselement te bepalen.
Opmerking: Gebruik deze gebundelde controle om de bepaling te standaardiseren en rekening voor alle mogelijke bekende (b.v. type matrix serum versus plasma, cycli bevriezen-ontdooien, cryopreservatie) en onbekende verstrengeling die invloed kunnen hebben op de experimentele variabiliteit 27 , 28.
- maken een controlemonster van gebundelde plasma of serum van alle studie monsters. Als 20 voorbeelden uitvoeren in elke plaat in drievoud, combineren 10 µL van elk monster in een besturingselement 200 µL gebundeld. Een aparte hoeveelheid van deze gebundelde controle geven het klinisch laboratorium de HDL-C waarde van dit besturingselement te bepalen.
- Voorbereiding van de controle van de kwaliteit van de laboratorium-specifieke (QCs)
- bereiden een grote voorraad van HDL in elk laboratorium (bijvoorbeeld HDL geïsoleerd van 5 mL plasma van 10 gezonde donoren) en verschillende hoeveelheden van dit cryopreserve voorraad te minimaliseren cycli bevriezen-ontdooien.
- Gebruik ten minste 10 verschillende repliceert uit deze voorraad om te bepalen van de gemiddelde waarde van HDLox. Een acceptabel bereik liggen van de gemeten HDLox waarden voor elk monster van de QC opgenomen in elke bepaling is binnen < 15% van de variatiecoëfficiënt van deze gemiddelde waarde.
- Geven een aparte hoeveelheid van deze gebundelde controle aan het klinisch laboratorium om te bepalen van de HDL-C waarde van dit besturingselement (bijvoorbeeld 40 mg/dL).
Opmerking: Een gedetailleerde aanpak van het gebruik van bloed van bloedbanken om deze besturingselementen te maken eerder geweest beschreven 27 , 28 , 32. Gebruik extra QCs zo nodig (bv ene een gezonde donor bekend dat normale HDL-functie en een van een donor bekend dat grotendeels abnormale functie van de HDL.
- Optimalisatie van achtergrond signaal en lege waarden (optioneel)
- te minimaliseren achtergrond, voeg de juiste hoeveelheid katalase (1-4 U/mL) in het incubatie-medium voor het snel verwijderen van het gevormde H 2 O 2 als gevolg van spontane lucht oxidatie van de buffers.
Opmerking: Aangezien de waarden uit de lege putten (geen HDL) zijn wordt afgetrokken van de waarden van de HDL-monsters en de resultaten worden gerapporteerd ten opzichte van een gebundelde controle (die is opgenomen in de dezelfde 96 goed plaat), we hebben gevonden dat deze stap niet praktisch bren doet t de resultaten. Dus, optimalisatie van het signaal van de achtergrond met katalase kan worden weggelaten, indien nodig.
- te minimaliseren achtergrond, voeg de juiste hoeveelheid katalase (1-4 U/mL) in het incubatie-medium voor het snel verwijderen van het gevormde H 2 O 2 als gevolg van spontane lucht oxidatie van de buffers.
4. Dag 1-scheiding van HDL Cholesterol HDL neerslag met
Opmerking: gebruik van een commercieel beschikbare gestandaardiseerde HDL Cholesterol neerslagmiddel reagens te isoleren van apoB uitgeput serum volgens de fabrikant ' s instructies. Deze reagentia worden veel gebruikt in colorimetrische testen om te bepalen van de HDL-cholesterolgehalte.
- Plasma of serum monster vers gebruiken (of ontdooien).
- Meng gelijke delen (bijvoorbeeld 80 µL) van plasma en HDL Cholesterol Precipiterend reagens (20% w/v polyethyleenglycol in glycine buffer met een pH van 10.0 (25 ° C)).
- Mix goed door omhoog en omlaag pipetteren.
- Centrifugeer bij 1000-2000 x g gedurende 10 minuten
- Gecombineerd het supernatant (HDL-Fractie).
- Idealiter gebruik onmiddellijk de geïsoleerde HDL voor de fluorochromeassay van HDL lipide peroxidatie. Echter als verschillende monsters worden uitgevoerd in dezelfde dag en andere stappen, zoals meting van de concentratie van HDL-cholesterol ook worden uitgevoerd, dan slaan de geïsoleerde HDL bij 4 ° C en de volgende dag gebruiken voor de functie van fluorochromeHDL Assay.
5. Dag 1-Determination of HDL-C in geïsoleerde HDL
Opmerking: dit is optioneel als de waarde van de HDL-C van het klinisch laboratorium door HDL-C bedrag wordt gebruikt om te normaliseren HDLox.
- Quantify de HDL-cholesterol uit plasma, met behulp van standaard colorimetrische 27 testen. Voeg 50 µL van Cholesterol reagens in elk putje en bepalen de cholesterol concentratie met behulp van een colorimetrische afleesapparaat en een cholesterol standaard voorzien in elke kit.
6. Dag 2-bereiding van reagentia
- HRP bereiden en cholesterol oplossingen van HRP 5 U/mL oplossing (Range 1-10 U/mL).
- Bereiden 20 mM fluorescerende (bijvoorbeeld Amplex rood) oplossingen: een flacon van fluorescerende reagens en DMSO op kamertemperatuur ontdooien. Vóór gebruik, ontbinden fluorescerende reagens (1 mg) in 200 µL van DMSO. Opslaan van de stockoplossing bevroren op ≤-20 ° C, beschermd tegen licht.
- Bereiden van positieve en negatieve controles: gebruik 1 X ' reactie buffer ' zonder cholesterol en 20 mM H 2 O 2 werkoplossing als een negatieve en positieve controles, respectievelijk.
7. Dag 2-fluorescerende Assay
- toevoegen 50 µL van 1 x reactie buffer als blanco (negatieve controle).
- Optioneel: 20 mM werkende oplossing van H 2 O 2 toevoegen als positieve controle in elke plaat.
- Minimaliseren van experimentele variabiliteit en ervoor zorgen dat toevoeging van reagentia en monsters consequent zijn gedaan en in een tijdig, het uitvoeren van alle toevoegingen voor samples in een afzonderlijke 96 goed ronde onderkant, zuivere, polystyreen of polypropyleen plaat (plaat 1). Gebruik vervolgens een meerkanaalspipet overbrengen van bepaalde volumes naar 3 96-wells-platen (2-4 platen: polypropyleen, platte botTom, zwart) (die hebben dezelfde lay-out) ( Figuur 2, Figuur 3).
- Bijvoorbeeld eerst het toevoegen van 160 µL van geïsoleerde HDL in elk goed/monster van plaat 1 en vervolgens met behulp van een meerkanaalspipet Breng 50 µL van HDL-cholesterol van elk goed/monster in de zwarte 96-wells-platen. Tips tussen elke rij/kolom wijzigen niet gefiltreerd geboden tips te gebruiken voor alle overdrachten.
- Verlaten monsters in de putjes. Gooi niet. Er zijn geen wassen stappen tussen toevoeging van reagentia.
- Toevoegen 50 µL van HRP oplossing 5 U/mL (0,25 U) aan elk putje.
NB: Gebruik HRP vóór de toevoeging van het fluorescerende reagens. - Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Gooi niet monsters na incubatie (geen wassen stappen tussen toevoegingen van reagentia).
- Toevoegen 50 µL van fluorochromereagent voor een eindconcentratie van 300 µM. Op dit punt, de totale reactie volume is 150 µL. Meng goed en beschermen tegen licht.
- Beoordelen de fluorescerende uitlezing (in het donker) elke minuut meer dan 120 minuten bij 37 ° C met een fluorescerende afleesapparaat (530/590 nm filters).
Opmerking: Gebruik een korter interval van 60 minuten met verse monsters. We hebben gevonden dat 120 minuten durende test geeft meer reproduceerbare gegevens met het gebruik van cryopreserved monsters. - Opnemen van gegevens met behulp van geschikte software.
8. Dag 3-Data analyse
- fluorescentie (willekeurige eenheden) opnemen op 120 minuten na toevoeging van het fluorescerende reagens voor alle monsters met inbegrip van lege wells en alle besturingselementen.
- Berekening van de gemiddelde waarde van fluorescentie eenheden (op basis van ten minste triplicates) (HDL ox_sample). Neem geen uitschieters (> 2 SDs van de gemiddelde waarde) in aanmerking.
- Aftrekken de achtergrond fluorescentie met behulp van de volgende vergelijking:
- normalisatie voor HDL cholesterol (HDL-C): de HDLox lipide peroxidatie waarde voor elk monster (met inbegrip van het gegroepeerde besturingselement) normaliseren door de HDL-C) (mg/dl). Via de sectie voor resultaten, wordt HDL ox gepresenteerd als n (HDL-C) HDLox maatregel aan de aanpassing voor HDL-C. De volgende vergelijking gebruiken:
- standaardiseren van de expressie van HDLox lipide peroxidatie waarde van elk monster tegen de waarde van een gebundelde controle. Normaliseren de n (HDL-C) HDLox lipide peroxidatie waarde voor elk monster (gecorrigeerd voor HDL-C) door de n (HDL-C) HDLox lipide peroxidatie waarde van het gegroepeerde besturingselement. Via de sectie voor resultaten, wordt HDL ox gepresenteerd als nHDL ox maatregel aan de aanpassing voor experimentele variabiliteit en HDL-C. De volgende vergelijking gebruiken:
Opmerking: deze benadering is vergelijkbaar met andere gevestigde experimentele benaderingen om experimentele variabiliteit van metingen, zoals International genormaliseerd ratio (INR) 44 , 45. Deze aanpak is gevalideerd in klinische studies 32 , 33 , 34 , 35, , 36 , 37 , 38 , 39. - kwaliteitscontrole van experimentele resultaten met behulp van standaard kwaliteit controlemonsters uitvoeren. Elk laboratorium dient zijn eigen kwaliteitscontroles (QCs) vastgesteld. Ideaal is er een QC voor nHDLox uit een monster met bekende disfunctionele HDL en een QC voor nHDLox uit een monster van gezonde donoren [bv gebruik gepoolde monster van jonge volwassenen die zijn gevestigde bloedbank donoren en hebben geen bekende comorbiditeit en risicofactoren voor hart-en vaatziekten met inbegrip van rookvrije]. Het laatste besturingselement standaardiseert resultaten tussen verschillende laboratoria. De gemiddelde waarden van deze QCs zijn vastgesteld op basis van ten minste 5 wordt gerepliceerd (meestal gebruiken we 10 replicatieonderzoeken voor deze belangrijke stap).
- Check of gemeten QCs in elke assay hebben waarden binnen het verwachte bereik van waarden. Uitgaande van een aanvaardbare maximale experimentele variabiliteit van 15%, moeten alle gemeten experimentele waarden vallen binnen 15% van de bekende gemiddelde waarden van gevestigde QC. De volgende vergelijkingen gebruiken:
Opmerking: als een van de meegeleverde kwaliteitscontrole monsters () normaal versus disfunctionele HDL) geeft HDLox waarden buiten verwachte bereik (opgericht in elk laboratorium) dan herhaal het experiment.
- Check of gemeten QCs in elke assay hebben waarden binnen het verwachte bereik van waarden. Uitgaande van een aanvaardbare maximale experimentele variabiliteit van 15%, moeten alle gemeten experimentele waarden vallen binnen 15% van de bekende gemiddelde waarden van gevestigde QC. De volgende vergelijkingen gebruiken:
- Uitvoeren van kwaliteitscontrole van experimentele resultaten met behulp van de variatiecoëfficiënt (CV) te kwantificeren van experimentele variabiliteit: Herhaal alle monsters met AVK % > 15%. De volgende vergelijking gebruiken:
Opmerking: een typische intra-assay (binnen de dezelfde plaat) en de Inter assay (onder verschillende platen) experimentele variabiliteit is < 15%. 2) een typische intra-assay CV is tussen 1-7% en een typische interassay CV tussen 3-10 ligt %.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
50 µL van elk monster HDL worden toegevoegd aan elk putje zoals in stap 7.3. 50 µL van HRP oplossing 5 U/mL (0,25 U) zijn vervolgens toegevoegd aan elk putje zoals in stap 7.5. Monsters worden gedurende 30 minuten bij 37 ° C als in stap 7.6 geïncubeerd. 50 µL van fluorescerende reagens worden vervolgens toegevoegd in elk putje zoals in stap 7.7 (eindconcentratie van 300 µM). De fluorescerende uitlezing (in het donker) wordt vervolgens beoordeeld voor elke minuut meer dan 120 minuten bij 37 ° C met een fluorescerende afleesapparaat (530/590 nm filters). Representatieve fluorescentie gegevens voor lege, gebundelde controle, monster met bekende disfunctionele HDL en monster met normale HDL worden weergegeven in Figuur 4. Ruwe gegevens van de vertegenwoordiger en stap voor stap analyse van de resultaten met behulp van de vergelijkingen beschreven in hoofdstuk 8 van het protocol worden weergegeven in tabel 1. In dit voorbeeld, verse HDL monsters werden gebruikt en hogere waarden van de HDLox zijn over het algemeen verkregen met verse HDL. Bijvoorbeeld, had HDL waarvan bekend is dat disfunctionele gebaseerd op onafhankelijke tests van HDL functie en van HIV-geïnfecteerde persoon ongeveer 2-fold relatief hogere hoeveelheid lipide peroxide vergeleken met gepoolde HDL uit gezonde deelnemers. Figuur 5 toont representatieve resultaten van een studie met onderwerpen bekend aan visueel gehandicapten HDL functie28,32. De HIV-geïnfecteerde personen had ongeveer 60% hoger bedoel HDL-lipide peroxidegehalte (per mg HDL-C) in vergelijking met de niet-geïnfecteerde personen. In onze eerdere gepubliceerde studies met cryopreserved HDL kon deze methode aantonen ten minste 10% relatieve verschillen in HDLox ten opzichte van HDL controle groepen (zonder ziekte bijvoorbeeld chronische HIV-infectie)36,37, 38.
Figuur 1: Bepaling van HDL lipide peroxidegehalte per bepaalde hoeveelheid HDL-C.
In Staten van systemische ontstekingen en oxidatieve stress verhoogd HDL lipide-peroxiden (LOOH) (HDLox) die gekoppeld aan verminderde functie van de HDL zijn. HRP katalyseert de oxidatie van niet-belichting fluorescerende fluorescerende aan fluorescerende resorufin rood. Deze oxidatie kan worden aangedreven door zowel endogene peroxiden aanwezig in de reactie (OH-) als HDL-lipide-peroxiden (LOOH-). Zonder cholesterol oxidase, resorufin (met HRP) kan het kwantificeren van de intrinsieke HDL lipide peroxidegehalte van een specifieke hoeveelheid HDL cholesterol. De productie van de achtergrond van OH - als gevolg van lucht oxidatie van de buffer wordt afgetrokken van de fluorescerende uitlezing van elk putje. Resorufin heeft een minimale autofluorescence in de meeste monsters. Deze figuur geweest gewijzigde 32. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Overzicht van de workflow voor de fluorochromeassay van HDL lipide peroxidatie.
Dag 0: Voorbereiding voor de assay: A) 96 goed plaat lay-outs ontwerpen, schatten van de omvang van de nodig monsters (plasma/serum) en reagentia (enzym HRP fluorescerende reagens, buffers, PEG-reagens), label buizen
Dag 1: Voorbereiding van de test en HDL isolatie: A) voorbereiding van controles (controle van de studie specifieke-gebundeld, kwaliteitscontroles, positieve en negatieve controles) B) HDL neerslag met behulp van PEG reagens.
Dag 2: Voorbereiding van de test (als niet gedaan in dag 1) en fluorescerende assay: A) voorbereiding van controles (controle van de studie specifieke-gebundeld, kwaliteitscontroles, positieve en negatieve controles) A) toevoeging van HDL monsters: om te minimaliseren van experimentele variabiliteit en ervoor zorgen dat de toevoeging van reagentia en monsters zal consequent worden gedaan en tijdig wordt aangeraden dat alle toevoegingen van monsters (bijvoorbeeld 160 µL) eerst worden gedaan in een aparte 96 goed ronde onderkant, transparant, polystyreen of polypropyleen plaat (plaat 1). Dan een meerkanaalspipet kan worden gebruikt voor de overdracht van bepaalde volumes (bijvoorbeeld 50 µL) in 3 96-wells-platen (2-4 platen: polypropyleen, vlakke bodem, zwarte platen) (die hebben dezelfde lay-out). B) toevoeging van HRP: toevoegen 50 µL van 5 U/mL (0,25 U) elke goed met een meerkanaalspipet C) Incubate bij 37 ° C gedurende 30 minuten D) toevoegen 50 µL van 300 µM/goed van fluorescerende reagens aan elke goed met een meerkanaalspipet E) beoordelen de fluorescerende uitlezing (in het donker) elke minuut meer dan 120 minuten bij 37 ° C met een fluorescerende afleesapparaat (530/590 nm filters).
Dag 3: Data-analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Vertegenwoordiger lay-out van 96 goed platen die meestal worden gebruikt in de functie van fluorescerende HDL Assay.
Verschillen in timing van toevoeging van HDL monsters in putjes van een plaat kunnen leiden tot verschillen in spontane oxidatie tussen verschillende putten. Minimaliseren van experimentele variabiliteit, variabele spontane oxidatie tussen verschillende putten te voorkomen en ervoor zorgen dat de toevoeging van reagentia en monsters zal consequent worden gedaan en tijdig, het is aanbevolen dat alle toevoegingen van monsters (bijvoorbeeld 160 µL) eerst gedaan in een aparte 96 goed ronde onderkant, transparant, polystyreen of polypropyleen plate (plaat 1). Dan een meerkanaalspipet kan worden gebruikt voor de overdracht van bepaalde volumes (bijvoorbeeld 50 µL) in 3 96-wells-platen (2-4 platen: polypropyleen, vlakke bodem, zwarte platen) (die hebben dezelfde lay-out). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Representatieve gegevens van HDL lipide peroxidatie assay.
De fluorescerende uitlezing (in het donker) wordt vervolgens beoordeeld voor elke minuut meer dan 120 minuten bij 37 ° C met een fluorescerende afleesapparaat (530/590 nm filters). Representatieve gegevens (willekeurige eenheden) worden weergegeven voor leeg (geen HDL; negatieve controles), positieve controle (H2O2), gebundelde HDL controle en HDL uit patiënt bekend dat disfunctionele HDL (op basis van twee onafhankelijke HDL-functie testen-cholesterol efflux en monocyt chemotaxis assay). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: De lipide peroxide bepaling van de HDL-functie kan detecteren hoge lipide peroxide inhoud per bepaalde hoeveelheid HDL-C in vivo.
HDL werd geïsoleerd en HDLox werd bepaald als beschreven in het Protocol in 50 gezonde proefpersonen en 100 patiënten met HIV-infectie. De HIV-geïnfecteerde personen had hogere HDLox (1.59±0.53) ten opzichte van de besturingselementen (1.01±0.31) (p < 0,001). Deze figuur geweest gewijzigde 32. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hier beschreven biedt een krachtige tool om belangrijke onderzoeksvragen met betrekking tot de rol van HDL functie in atherosclerose en ziekten bij de mens te beantwoorden. De assay kwantificeert de HDL lipide-peroxidegehalte per mg HDL-C met behulp van enzymatische versterking (HRP). Deze aanpak voorkomt bekende beperkingen van voorafgaande HDL functie tests (bv de cholesterol efflux assay) met inbegrip van aanzienlijke heterogeniteit met betrekking tot de soorten cellen gebruikt, soort uitlezing gemeld, gebrek aan standaardisatie en storende effecten van triglyceriden7,15,32. Bepaling van biochemische in plaats van de biologische eigenschappen (bijvoorbeeld cholesterol efflux) van HDL kan meer reproduceerbaar zijn. De Inter assay experimentele variabiliteit van < 10% gunstig vergeleken met de cel-gebaseerde testen van HDL functie, waar evaluaties experimentele variabiliteit vaak is > 15% (of niet gemeld). Bovendien, deze aanpak mogen de biochemische interacties tussen lipiden en TL sondes32. Bepaling van HDL oxidatie is relevant in de context van cardiovasculaire ziekten, gezien de belangrijke rol van oxidatieve stress binnen de arteriële muur in de pathogenese van atherogenese 46. Wij zijn gewend dat de fluorescerende HDL functie assay verminderde HDL functie detecteren in Staten van chronische oxidatieve stress zoals atherosclerose en Humaan Immunodeficiëntie Virus (HIV) infectie32. Met behulp van biochemische kwantitatieve analyse van HDL functie, hebben verschillende studies bevestigd dat de vereniging van HDLox met obesitas en hart-en vaatziekten 19,21,27,34,35 4736, ,. Aanzienlijk, in menselijke pilotstudies we bewezen verenigingen van HDLox met gevalideerde cel-gebaseerde testen, vervangend maatregelen systemische ontstekingen, immuun disfunctie en hart-en vaatziekten en cardiovasculaire en metabole risico verbonden fenotypen32,36. Hoewel deze test is gebruikt in verschillende studies inspelen op de rol van HDL functie in verschillende ziekten zoals chronische HIV infectie32,38, atherosclerose 32 en obesitas36, blijft het gevalideerd in grootschalige studies met beschikbare klinische eindpunten van CVD (bijvoorbeeld een hartinfarct).
De reactie van de fluorescerende peroxiden in aanwezigheid van HRP te produceren zeer fluorescerende resorufin is goed ingeburgerd 48,49. HRP katalyseert de oxidatie van niet-belichting fluorescerende fluorescerende TL resorufin rood50,51. Deze oxidatie kan worden aangedreven door zowel endogene peroxiden aanwezig in de reactie (OH-) als HDL-lipide-peroxiden (LOOH-). Zonder cholesterol oxidase, resorufin (met HRP) kan het kwantificeren van de intrinsieke HDL lipide peroxidegehalte van een specifieke hoeveelheid HDL cholesterol. De productie van de achtergrond van OH - als gevolg van lucht oxidatie van de buffer wordt afgetrokken van de fluorescerende uitlezing van elk putje. Resorufin heeft een minimale autofluorescence in de meeste monsters. Toevoeging van katalase (1-4 U/mL) in de reactie buffer kan endogene peroxiden snel verzachten, zodat de toename van de fluorescerende uitlezing na verloop van tijd wordt gedreven door HDL lipide-peroxiden. De bepaling is veelzijdig en peroxidegehalte van het lipide in HDL cholesteryl esters versus gratis HDL cholesterol32,48,49 kan beoordelen.
Er zijn vele variaties van de fluorescerende HDL functie Assay32. Kort er zijn ten minste 3 belangrijke benaderingen: een) Voeg een specifieke hoeveelheid HDL (bijvoorbeeld 50 µL) per putje toe en later het normaliseren van de HDL lipide peroxidatie waarde door het niveau van de HDL-C zoals bepaald in het klinisch laboratorium; b) Bepaal de concentratie van HDL-C in elk monster gebaseerd op standaard colorimetrische cholesterol testen en voeg vervolgens een specifieke hoeveelheid HDL-C (bv 1 µg) per putje; en c) het normaliseren van de HDL-functie uitlezing door HDL of apoA-ik eiwit inhoud32. Er zijn ook minstens 3 belangrijke benaderingen over hoe te isoleren van HDL voor HDL lipide peroxidatie testen: a) HDL Cholesterol precipitatie met polyethyleenglycol; BV b) Immunoaffinity vastleggen; en c) andere niet high-throughput standaardmethoden voor HDL isolatie zoals µLtracentrifugation32. Daarnaast is de bepaling is veelzijdig en peroxidegehalte van het lipide in HDL cholesteryl esters versus gratis HDL cholesterol 32kan beoordelen. Er zijn verschillende manieren om te melden dat de resultaten bijvoorbeeld willekeurige fluorescentie eenheden, gestandaardiseerde resorufin fluorescentie, genormaliseerd in verhouding tot een gebundelde controle-32. Hierin presenteren wij de meest reproduceerbare aanpak.
Als plasma wordt gebruikt is het belangrijk om voor te bereiden van plasma in buizen moeten Natriumcitraat als de anticoagulatie 27,-28. EDTA40 en heparine sulfaat kan interfereren met oxidatie reacties 41,42. Heparine sulfaat kan interfereren met de biochemische tests van HDL functie 27,28. Hoewel cryopreserved serum en plasma suboptimaal voor bepaling van lipiden, HDL functie en HDL lipide peroxidatie zijn, kunnen cryopreserved monsters kwantificeren relatieve verschillen in HDL lipide peroxidatie per mg van HDL. Het is belangrijk voor het verwerken van alle monsters binnen een specifieke studie in exact dezelfde manier (bijvoorbeeld dezelfde bevriezen-ontdooien cycli) en omvatten een gegroepeerde besturingselement in elke plaat ter verantwoording voor mogelijke verstrengeling gerelateerde verschillen bij de verwerking van het monster onder verschillende onderzoeken. Op lange termijn cryopreservatie kan in gevaar komen de resultaten van HDL functie testen43 maar relatieve verschillen in HDL lipide peroxidatie onder monsters binnen één studie kunnen nog steeds worden beoordeeld als een bijbehorend gegroepeerde besturingselement gebruikte 27, 28.
Nog belangrijker is, zijn voorafgaande HDL functie tests niet gestandaardiseerd. Hier beschrijven we een aanpak waar gebruik van passende controles zorgt voor standaardisatie van de uitlezing. Meer specifiek zijn er verschillende bekende parameters die van invloed kunnen zijn op de uitlezing van biochemische tests van HDL functioneren zoals matrixeffecten (serum vs methode voor de bereiding van het plasma), aanwezigheid van albumine en andere proteïnen, cryopreservatie, bevriezen-ontdooien 32. het HDL functie fluorescerende assay kan worden herleid met het gebruik van commercieel beschikbare normen en experimentele reagentia32. Er zijn echter ookverschillende onbekende (of slecht gekarakteriseerd) verstrengeling in elk bestuderen en onder verschillende personen die invloed kunnen hebben op de bepaling van HDL functie resultaten. Dus, in elke plaat gebruiken we een gebundelde HDL-besturingselement bereid uit de specifieke specimens van belang in een bepaalde studie (die identiek zijn verwerkt) die artefacten en verstrengeling32minimaliseert. Gebruik van plasma bloedbank monsters en HDL-C waarden uit het klinisch laboratorium kan verder de assay32standaardiseren.
Wij hebben eerder aangetoond dat verschillende methoden van HDL isolatie beduidend de uitlezing van biochemische tests van HDL functie 27,28,32 beïnvloeden kunnen , maar de fluorescerende betrouwbaar HDLox ongeacht meten kan van de HDL isolatie 32. HDL isolatie methoden zijn een belangrijke beperkende factor voor high-throughput onderzoek van HDL functie. Ultracentrifugatie wordt beschouwd als de referentiemethode vandaag, maar blijft een tijdrovende methode52. Elektroforese is onnauwkeurig en niet gestandaardiseerd 53. HDL neerslag methodes omvatten het gebruik van polyanions zoals polyethyleenglycol (PEG) te precipiteren lipoproteins van de lage dichtheid de HDL verlaten in het supernatant 54. Hoewel deze methoden bepaalde nadelen zoals variabele resultaten met lipemic serums en storingen bij de enzymatische cholesterol procedures 55 voorafgaande wijzigingen weergegeven op gestandaardiseerde de oorspronkelijke procedure met behulp van verkrijgbare reagentia levert een eenvoudige, betrouwbare en nauwkeurige procedure56. Hoewel PEG neerslag meest gebruikte methode om te isoleren van HDL21,57 van patiënten serum is, is een belangrijke kwestie de aanwezigheid van non-HDL eiwitten zoals albumine58. Immunoaffinity isolatie kan worden gebruikt om te minimaliseren van het effect van albumine op HDL functie 32. Hoewel de relatieve verschillen in HDLox voor een specifieke capture-methode kunnen worden beoordeeld, kunnen specifieke antilichamen tegen HDL niet volledig vastleggen complexe HDL structuren. Met de juiste besturingselementen zoals beschreven in dit protocol, kunnen relatieve verschillen in HDLox tussen HDL specimens (geïsoleerd door PEG neerslag) op betrouwbare wijze bepaald worden.
Deze bepaling, zoals alle andere testen van HDL functie, heeft belangrijke beperkingen. In vivo oxidatie van HDL in de arteriële muur is vrij complexe en heterogene en lipide peroxidegehalte kan slechts gedeeltelijk overeen met HDLox46. HDL-structuur en functie continu veranderingen in vivo en meting van HDL functie op één timepoint kan niet overeen met de impact van HDL dysfunctie in einde orgel ziekte over tijd59. Het is niet bekend of de uitlezing van de HDLox moet worden genormaliseerd door de HDL-C, of HDL eiwit 22. Toekomstige klinische studies moeten het valideren van het belang van de uitlezing van de bepaling (HDL lipide peroxidegehalte per mg HDL-C).
Kortom, is de fluorescerende HDL functie assay een betrouwbare methode voor de bepaling van de HDL lipide-peroxidegehalte per bepaalde hoeveelheid HDL (HDLox). Hogere HDLox waarden worden geassocieerd met verlaagde HDL anti-oxidant functie. De uitlezing van deze bepaling wordt geassocieerd met gevalideerde cel-gebaseerde testen, surrogaat maatregelen van hart-en vaatziekten, systemische ontsteking, immuun disfunctie en bijbehorende risico van cardiovasculaire en metabole fenotypen 19, 21,27,32,34,35,,36,,37,38,39, 47. deze methode biedt een handige, maar toch robuust hulpmiddel voor de behandeling van de rol van HDL functie in ziekten bij de mens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dit protocol en de kwantitatieve analyse zijn relevant voor de patent PCT/US2015/018147.
Acknowledgments
De auteurs mijn dankbaarheid uitspreken voor het werk van Dr Mohamad Navab, Alan Fogelman en Srinivasa Reddy voor hun sleutelrol in de ontwikkeling van eerdere iteraties van dit model. T.A.A. wordt ondersteund door een RMIT University Vice-kanselier van postdoctorale Fellowship. AJ en AH worden ondersteund door NHMRC projectsubsidie 1108792. TK wordt ondersteund door NIH grants NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # µL1TR000124.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Experimental Reagents | |||
| HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent | Pointe Scientific | H7511 | |
| Amplex Red reagent. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| DMSO. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Horse Radish Peroxidase (HRP) | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Esterase. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Resorufin fluorescense Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| 5x Reaction Buffer. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| HDL Cholesterol Automated Reagent | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | TR39601 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). | Sigma Aldrich | M0687 | |
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). | Sigma Aldrich | M9936 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| ClipTip 200, sterile | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-488-058 | |
| Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125 | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-387--955 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Gen5 2.01 software | Biotek, Vermont, USA | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gen5 Plate reader | Biotek, Vermont, USA | NA |
References
- Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein--the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
- Rubins, H. B., et al. Gemfibrozil for the secondary prevention of coronary heart disease in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol. Veterans Affairs High-Density Lipoprotein Cholesterol Intervention Trial Study Group. N Engl J Med. 341, 410-418 (1999).
- Voight, B. F., et al. Plasma HDL cholesterol and risk of myocardial infarction: a mendelian randomisation study. Lancet. 380, 572-580 (2012).
- Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat.Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
- Navab, M., et al.
- Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Anantharamaiah, G. M., Fogelman, A. M. The role of dysfunctional HDL in atherosclerosis. J Lipid Res. 50, Suppl . S145-S149 (2009).
- Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
- Patel, S., et al. Reconstituted high-density lipoprotein increases plasma high-density lipoprotein anti-inflammatory properties and cholesterol efflux capacity in patients with type 2 diabetes. J Am Coll Cardiol. 53, 962-971 (2009).
- Navab, M., et al. HDL and the inflammatory response induced by LDL-derived oxidized phospholipids. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21, 481-488 (2001).
- Hayek, T., Oiknine, J., Brook, J. G., Aviram, M. Role of HDL apolipoprotein E in cellular cholesterol efflux: studies in apo E knockout transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun. 205, 1072-1078 (1994).
- Van Lenten, B. J., et al. Anti-inflammatory HDL becomes pro-inflammatory during the acute phase response. Loss of protective effect of HDL against LDL oxidation in aortic wall cell cocultures. J Clin Invest. 96, 2758-2767 (1995).
- Undurti, A., et al. Modification of high density lipoprotein by myeloperoxidase generates a pro-inflammatory particle. J Biol Chem. 284, 30825-30835 (2009).
- Van Lenten, B. J., et al. Lipoprotein inflammatory properties and serum amyloid A levels but not cholesterol levels predict lesion area in cholesterol-fed rabbits. J Lipid Res. 48, 2344-2353 (2007).
- Watson, C. E., et al. Treatment of patients with cardiovascular disease with L-4F, an apo-A1 mimetic, did not improve select biomarkers of HDL function. J Lipid Res. 52, 361-373 (2011).
- Annema, W., et al. Impaired HDL cholesterol efflux in metabolic syndrome is unrelated to glucose tolerance status: the CODAM study. Sci Rep. 6, 27367 (2016).
- Movva, R., Rader, D. J. Laboratory assessment of HDL heterogeneity and function. Clin Chem. 54, 788-800 (2008).
- Charles-Schoeman, C., et al. Abnormal function of high-density lipoprotein is associated with poor disease control and an altered protein cargo in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 60, 2870-2879 (2009).
- Imaizumi, S., et al. L-4F differentially alters plasma levels of oxidized fatty acids resulting in more anti-inflammatory HDL in mice. Drug Metab Lett. 4, 139-148 (2010).
- Khera, A. V., et al. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364, 127-135 (2011).
- Morgantini, C., et al. Anti-inflammatory and antioxidant properties of HDLs are impaired in type 2 diabetes. Diabetes. 60, 2617-2623 (2011).
- Patel, P. J., Khera, A. V., Jafri, K., Wilensky, R. L., Rader, D. J. The anti-oxidative capacity of high-density lipoprotein is reduced in acute coronary syndrome but not in stable coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 58, 2068-2075 (2011).
- Watanabe, J., et al. Proteomic profiling following immunoaffinity capture of high-density lipoprotein: association of acute-phase proteins and complement factors with proinflammatory high-density lipoprotein in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 64, 1828-1837 (2012).
- Watanabe, J., et al. Differential association of hemoglobin with proinflammatory high density lipoproteins in atherogenic/hyperlipidemic mice. A novel biomarker of atherosclerosis. J Biol Chem. 282, 23698-23707 (2007).
- Watanabe, J., et al. Hemoglobin and its scavenger protein haptoglobin associate with apoA-1-containing particles and influence the inflammatory properties and function of high density lipoprotein. J Biol Chem. 284, 18292-18301 (2009).
- Wang, X. S., et al. A sensitive and specific ELISA detects methionine sulfoxide-containing apolipoprotein A-I in HDL. J Lipid Res. 50, 586-594 (2009).
- Navab, M., et al. A cell-free assay for detecting HDL that is dysfunctional in preventing the formation of or inactivating oxidized phospholipids. J Lipid Res. 42, 1308-1317 (2001).
- Kelesidis, T., et al. A biochemical fluorometric method for assessing the oxidative properties of HDL. J Lipid Res. 52, 2341-2351 (2011).
- Kelesidis, T., et al. Effects of lipid-probe interactions in biochemical fluorometric methods that assess HDL redox activity. Lipids Health Dis. 11, 87 (2012).
- Navab, M., et al. Mechanisms of disease: proatherogenic HDL--an evolving field. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2, 504-511 (2006).
- Navab, M., et al. The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role of oxidized phospholipids and HDL. J Lipid Res. 45, 993-1007 (2004).
- Morgantini, C., et al. HDL lipid composition is profoundly altered in patients with type 2 diabetes and atherosclerotic vascular disease. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 24, 594-599 (2014).
- Kelesidis, T., et al. A high throughput biochemical fluorometric method for measuring lipid peroxidation in HDL. PLoS One. 9, e111716 (2014).
- Kelesidis, T., Yang, O. O., Kendall, M. A., Hodis, H. N., Currier, J. S. Dysfunctional HDL and progression of atherosclerosis in HIV-1-infected and -uninfected adults. Lipids Health Dis. 12, 23 (2013).
- Zanni, M. V., et al. HDL redox activity is increased in HIV-infected men in association with macrophage activation and non-calcified coronary atherosclerotic plaque. Antivir Ther. 19, 805-811 (2014).
- Roberts, C. K., Katiraie, M., Croymans, D. M., Yang, O. O., Kelesidis, T. Untrained young men have dysfunctional HDL compared with strength-trained men irrespective of body weight status. J Appl Physiol (1985). , 1043-1049 (2013).
- Davidson, W. S., et al. Weight loss surgery in adolescents corrects high-density lipoprotein subspecies and their function. Int J Obes (Lond). 41, 83-89 (2017).
- Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J Acquir Immune Defic Syndr. , (2017).
- Kelesidis, T., et al. Oxidized lipoproteins are associated with markers of inflammation and immune activation in HIV-1 infection. AIDS. 30, 2625-2633 (2016).
- Kelesidis, T., et al. Changes in plasma levels of oxidized lipoproteins and lipoprotein subfractions with atazanavir-, raltegravir-, darunavir-based initial antiviral therapy and associations with common carotid artery intima-media thickness: ACTG 5260s. Antivir Ther. , (2016).
- Bhattacharyya, D. K., Adak, S., Bandyopadhyay, U., Banerjee, R. K. Mechanism of inhibition of horseradish peroxidase-catalysed iodide oxidation by EDTA. Biochem J. 295 (Pt 2), 281-288 (1994).
- Rees, M. D., Pattison, D. I., Davies, M. J. Oxidation of heparan sulphate by hypochlorite: role of N-chloro derivatives and dichloramine-dependent fragmentation. Biochem J. 391, 125-134 (2005).
- Mani, K., Cheng, F., Fransson, L. A. Heparan sulfate degradation products can associate with oxidized proteins and proteasomes. J Biol Chem. 282, 21934-21944 (2007).
- Finley, P. R., Schifman, R. B., Williams, R. J., Lichti, D. A. Cholesterol in high-density lipoprotein: use of Mg2+/dextran sulfate in its enzymic measurement. Clin Chem. 24, 931-933 (1978).
- von Schenck, H., Jacobsson, M. L. Prothrombin assay standardized with an international normalization ratio (INR): goal and reality. Clin Chem. 33, 342 (1987).
- de Kok, J. B., et al. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab Invest. 85, 154-159 (2005).
- Stocker, R., Keaney, J. F. Jr
- Holzer, M., et al. Aging affects high-density lipoprotein composition and function. Biochim Biophys Acta. 1831, 1442-1448 (2013).
- Amundson, D. M., Zhou, M. Fluorometric method for the enzymatic determination of cholesterol. J Biochem Biophys Methods. 38, 43-52 (1999).
- Mishin, V., Gray, J. P., Heck, D. E., Laskin, D. L., Laskin, J. D. Application of the Amplex red/horseradish peroxidase assay to measure hydrogen peroxide generation by recombinant microsomal enzymes. Free Radic Biol Med. 48, 1485-1491 (2010).
- Lombardi, A., et al. UCP3 translocates lipid hydroperoxide and mediates lipid hydroperoxide-dependent mitochondrial uncoupling. J Biol Chem. 285, 16599-16605 (2010).
- Bhattacharya, A., et al. Denervation induces cytosolic phospholipase A2-mediated fatty acid hydroperoxide generation by muscle mitochondria. J Biol Chem. 284, 46-55 (2009).
- Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of µLtracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest. 34, 1345-1353 (1955).
- Dyerberg, J. Comments on the quantitation of lipoproteins by agarose-gel electrophoresis. Clin Chim Acta. 61, 103-104 (1975).
- Warnick, G. R., Cheung, M. C., Albers, J. J. Comparison of current methods for high-density lipoprotein cholesterol quantitation. Clin Chem. 25, 596-604 (1979).
- Demacker, P. N., Hijmans, A. G., Vos-Janssen, H. E., van't Laar, A., Jansen, A. P. A study of the use of polyethylene glycol in estimating cholesterol in high-density lipoprotein. Clin Chem. 26, 1775-1779 (1980).
- Izzo, C., Grillo, F., Murador, E. Improved method for determination of high-density-lipoprotein cholesterol I. Isolation of high-density lipoproteins by use of polyethylene glycol 6000. Clin Chem. 27, 371-374 (1981).
- Patel, P. J., Khera, A. V., Wilensky, R. L., Rader, D. J. Anti-oxidative and cholesterol efflux capacities of high-density lipoprotein are reduced in ischaemic cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 15, 1215-1219 (2013).
- Roche, M., Rondeau, P., Singh, N. R., Tarnus, E., Bourdon, E. The antioxidant properties of serum albumin. FEBS Lett. 582, 1783-1787 (2008).
- Panzenbock, U., Kritharides, L., Raftery, M., Rye, K. A., Stocker, R. Oxidation of methionine residues to methionine sulfoxides does not decrease potential antiatherogenic properties of apolipoprotein A-I. J Biol Chem. 275, 19536-19544 (2000).
