تطبيق متعدد الألوان فلبوت تقنية لدراسة عالية الدقة مورفولوجيس وحيد الخلية والتفاعلات بين الخلايا لإطلاق في المورفولوجية
Summary
عرض مورفولوجيس مختلف الخلايا وإنشاء مجموعة متنوعة من التفاعلات مع جيرانهم. هذا البروتوكول يصف كيف تكشف مورفولوجية الخلايا المفردة والتحقيق التفاعل خلية-خلية باستخدام نظام التعبير Gal4/UAS الراسخة.
Abstract
تعرض الخلايا مورفولوجيس مختلفة ومعقدة من العلاقات التشريحية. كيف تتفاعل مع جيرانهم الخلايا؟ هل تختلف التفاعلات بين أنواع الخلايا أو حتى داخل نوع معين؟ ما هي أنواع القواعد المكانية أنها تتبع؟ الإجابات على هذه الأسئلة الأساسية في فيفو أعاقت حتى الآن عدم وجود أدوات لتسمية خلية مفردة عالية الدقة. ويرد هنا، بروتوكول مفصل لاستهداف الخلايا المفردة مع تقنية متعددة الألوان فلبوت (مكفو). ويعتمد هذا الأسلوب على المعلمة بشكل مختلف الصحفيين الثلاثة (هكتار، والعلم و V5) تحت سيطرة UAS التي يحتفظ بها صامتة بفاصل النسخي يحف به موقعين معاهدة سجل الأفلام (FRT-توقف-معاهدة سجل الأفلام). نبضة صدمة حرارة الحث على التعبير عن الحرارة الناجمة عن صدمة حزب العمل الفيجي recombinase، الذي يزيل أشرطة FRT-توقف-معاهدة سجل الأفلام عشوائياً في الخلايا الفردية: التعبير يحدث فقط في الخلايا التي نعرب أيضا عن برنامج تشغيل GAL4. وهذا يؤدي إلى مجموعة خلايا الملونة بشكل مختلف من نوع خلية معينة يسمح تصور مورفولوجيس الخلايا الفردية بدقة عالية. على سبيل مثال، يمكن الجمع بين تقنية مكفو مع السائقين GAL4 الدبقية محددة لتصور مورفولوجيس من مختلف الأنواع الفرعية الدبقية في الدماغ المورفولوجية الكبار.
Introduction
إطلاق، السكان الخلايا غير العصبية للجهاز العصبي (NS)، منذ فترة طويلة ويعتقد أن توفير إطار ثابت للخلايا العصبية ولم تدرس بالتفصيل لذلك. ومع ذلك، في البشر، وإطلاق تشكل الغالبية العظمى من الخلايا الموجودة في NS (~ 90%)، وتنقسم إلى عدة فئات مختلفة، بما في ذلك أستروسيتيس، أوليجوديندروسيتيس، ميكروجليا وخلايا شوان. في المورفولوجية، يشكل إطلاق حوالي 10% الخلايا في NS. الفضول، مورفولوجيس، والوظائف ملحوظ مماثلة لتلك التي عثر عليها في الفقاريات1،2. وتشمل على مورفولوجيس حاجز الدم – المخ (BBB) تشكيل ابيثيليا، وجرت، وأستروسيتي مثل الخلايا.
المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي (CNS) يتكون من الهياكل الرئيسية التالية: مناطق القشرة التي تحتوي على جثث الخلايا العصبية؛ نيوروبيلس التي تأوي متشابك الاتصالات؛ مساحات إكسون الصغيرة والكبيرة التي تربط نيوروبيليس مختلفة؛ الأعصاب المحيطية التي تربط الحواس والعضلات مع الجهاز العصبي المركزي (الشكل 1). إطلاق توجد المرتبطة بجميع هذه الهياكل التشريحية: إطلاق اللحاء (CG) في المناطق القشرية، أستروسيتي–مثل إطلاق (ALG) وإطلاق جرت (مثلاً) في مناطق نيوروبيلي، إطلاق جرت ترتبط أيضا بمساحات إكسون المركزية والطرفية الأعصاب (الأسماء)، وأخيراً، هما مثل ورقة إطلاق، إطلاق بيرينيوريال (PG) وسوببيرينيوريال (SPG)، التي تشكل معا طبقة متجاورة تغطي NS كامل (الشكل 2).
وقد أظهرت الدراسات السابقة أن إطلاق تلعب أدواراً هامة في تنمية NS؛ أنها رصد إعداد الخلايا العصبية باﻻستجابة لتعميم عناصره الببتيدات الشبيهة بالانسولين وتوفير الدعم الغذائي للخلايا العصبية، مثل المكوك لاكتات astrocyte-العصبية، والقضاء على الخلايا العصبية الموت عن طريق البلعمه3،4 , 5 , 6-في NS ناضجة، إطلاق الحفاظ على بي بي بي، وتناول العصبية والحفاظ على التوازن الأيونية، بمثابة الخلايا المناعية الرئيسية في NS، منذ الضامة لا يخل بي بي بي، وتعدل النشاط متشابك، فضلا عن سلوك الحيوانات6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
ما إذا كانت الأنواع الفرعية الدبقية مختلفة المهام المتخصصة تظل مسألة مفتوحة هامة. ومع ذلك، إجراء تحليل منهجي على نطاق الجينوم لإطلاق، خصوصا في الكبار، قد أعاق الافتقار إلى الأدوات الوراثية المناسبة للتلاعب بهم. ويرد هنا، أسلوب يسمح توصيف الأشكال الخلية لدراسة التفاعلات المعقدة خلية-خلية فعالة وسهلة. تم تطبيق هذا الأسلوب لتحديد خصائص مورفولوجية مختلفة الأنواع الفرعية الدبقية في الدماغ المورفولوجية الكبار، ولكن تبعاً للسائق GAL4 المحددة المستخدمة، فإنه يمكن تكييفها لدراسة الخلايا العصبية12،13 ، أي نوع من خلايا الاختلاط، ومن حيث المبدأ أي الأنسجة في أي من مراحل النمو.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف هذا البروتوكول طريقة سهلة وفعالة لدراسة مورفولوجية أنواع الخلايا المختلفة داخل أنسجة للاهتمام بدقة عالية. مع تقنية مكفو، تستخدم الصحفيين متعددة مع العلامات حانمه مختلفة في تركيبة لوسم العشوائية متعددة الألوان (الشكل 2). مماثلة إلى أساليب أخرى مثل برينبوو/فليبو<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون أرنيم جينيت، Nern الجوشا، وأعضاء آخرين في مختبر روبين للحصول على المشورة وتقاسم الكواشف غير منشورة و “جانيليا يطير فريق المشروع الضوء” لتوليد الصور [كنفوكل]. يشكر المؤلفون أيضا أعضاء المختبر بلاد الغال للتعليقات على المخطوطة.
Materials
| Water bath | Grant | GD100 | |
| PCR tubes | Sarstedt | 72.737.002 | |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Dissecting dish 30 mm x 12 mmm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dish |
| Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate | Corning | 7223-34 | Glass dissection plates |
| Sylgard Black | SYLGARD, Sigma-Aldrich | 805998 | home made with charcoal |
| ExpressFive S2 cell culture medium | Invitrogen | 10486-025 | |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Roth | 3051.3 | |
| Normal goat serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | |
| Normal donkey serum | Jackson Laboratories | 017-000-121 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| Rabbit HA-tag | Cell Signaling | C29F4 | Primary antibody, dilution 1:500 |
| Rat FLAG-tag | Novus Biologicals | NBP1-06712 | Primary antibody, dilution 1:100 |
| Mouse V5-tag:DyLight 549 | AdSerotec | 0411 | Conjugated antibody, dilution 1:200 |
| anti-rabbit AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11034 | Secondary antibody, dilution 1:250 |
| anti-rat DyLight 647 | Jackson Laboratories | 712-605-153 | Secondary antibody, dilution 1:100 |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SlowFate Gold | Invitrogen | S36937 | |
| Secure Seal Spacer | Grace Biolabs | Contact company for ordering | |
| Microscope cover glass 22 X 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Microscope cover glass 22 x 22 mm | Roth | H874 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ6 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | ||
| Immersol | Zeiss | 518 F | Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free |
| Immersol | Zeiss | W 2010 | Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free |
| R56F03-GAL4 (EG) | Bloomington Stock Center | 39157 | GAL4 driver |
| R86E01-GAL4 (ALG) | Bloomington Stock Center | 45914 | GAL4 driver |
| hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 | Bloomington Stock Center | 64085 | UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php) |
| Fiji (Image J) | Image analysis software | ||
| Multi Time Macro | Zeiss | Software for automated scanning |
References
- Freeman, M. R., Doherty, J. Glial cell biology in Drosophila and vertebrates. Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).
- Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. Analysis of glial cell development and function in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).
- Corty, M. M., Freeman, M. R. Cell biology in neuroscience: Architects in neural circuit design: Glia control neuron numbers and connectivity. J Cell Biol. 203 (3), 395-405 (2013).
- Hidalgo, A., Kato, K., Sutcliffe, B., McIlroy, G., Bishop, S., Alahmed, S. Trophic neuron-glia interactions and cell number adjustments in the fruit fly. Glia. 59 (9), 1296-1303 (2011).
- Liu, J., Speder, P., Brand, A. H. Control of brain development and homeostasis by local and systemic insulin signalling. Diabetes Obes Metab. 16, 16-20 (2014).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133 (3), 498-509 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Edenfeld, G., Stork, T., Klambt, C. Neuron-glia interaction in the insect nervous system. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 34-39 (2005).
- Oland, L. A., Tolbert, L. P. Key interactions between neurons and glial cells during neural development in insects. Annu Rev Entomol. 48, 89-110 (2003).
- Stork, T., Sheehan, A., Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Neuron-glia interactions through the Heartless FGF receptor signaling pathway mediate morphogenesis of Drosophila astrocytes. Neuron. 83 (2), 388-403 (2014).
- Zwarts, L., Van Eijs, F., Callaerts, P. Glia in Drosophila behavior. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 201 (9), 879-893 (2015).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Svoboda, K., Rubin, G. M. Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14198-14203 (2011).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (22), E2967-E2976 (2015).
- Viswanathan, S., Williams, M. E., Bloss, E. B., Stasevich, T. J., Speer, C. M., Nern, A., Pfeiffer, B. D., Hooks, B. M., Li, W. P., English, B. P., Tian, T., Henry, G. L., Macklin, J. J., Patel, R., Gerfen, C. R., Zhuang, X., Wang, Y., Rubin, G. M., Looger, L. L. High-performance probes for light and electron microscopy. Nat Methods. 12 (6), 568-576 (2015).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Hampel, S., Chung, P., McKellar, C. E., Hall, D., Looger, L. L., Simpson, J. H. Drosophila Brainbow: A recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns. Nat Methods. 8 (3), 253-259 (2011).
- Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster. Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).
- Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. M., Gaul, U. The glia of the adult Drosophila nervous system. Glia. 65 (4), 606-638 (2017).
