C. Elegans Darm als ein Modell für die interzelluläre Lumen Morphogenese und In Vivo polarisiert Membrane Biogenesis Ebene der einzelligen: Kennzeichnung durch Antikörper Färbung, RNAi Verlustfunktion Analyse und Bildgebung

Die Generation zellulärer und subzellulärer Asymmetrien, z. B. die Bildung von polarisierten Membrandomänen ist entscheidend für die Morphogenese und Funktion von Zellen, Geweben und Organen¹. Studien über polarisierte Membran Biogenese in Epithelien bleiben eine technische Herausforderung, da mehrere aufeinander folgende und deckungsgleich extrazellulären und intrazellulären Signale Richtungsänderungen bei der Zuweisung von subzelluläre Komponenten abhängen, die schwer zu trennen, bei den meisten Modellen und stark abhängig von dem Modellsystem. Das Modell präsentiert hier – die einschichtige Caenorhabditis Elegans Darm – ist ein Gewebe von exquisite Einfachheit. Zusammen mit den einzelligen C. Elegans Ausscheidungsorgane canal (siehe begleitende Papier auf polarisierte Membran Biogenese in C. Elegans Ausscheidungsorgane Kanals)², sondern bietet einige einzigartige Vorteile für die Identifizierung und Charakterisierung von Molekülen für polarisierte Membran Biogenese erforderlich. Die Erhaltung der molekulare Polarität Hinweise aus Hefe Mann machen dieses einfache Wirbellosen Organ eine ausgezeichnete“in Vivo Gewebe Kammer” Fragen von epithelialen Polarität, die von unmittelbarer Relevanz für das menschliche System sind die immer noch viel zu Hotel gelangen die visuelle Zerlegung dieser Ereignisse an der einzigen Zelle Ebene in Vivo.

Obwohl mehrere erhaltene Polarität Hinweise aus (1) die Extracelluar Matrix, (2) die Plasmamembran und Kreuzungen und (3) intrazellulären vesikuläre Menschenhandel identifiziert³, die zugrunde liegenden Prinzipien ihrer Integration in den Prozess der wurden polarisierten epithelialen Membran und Gewebe Biogenese ist schlecht verstandene⁴. Die klassische einzellige in-Vivo -Modelle (e.g.S. Cerevisiae und C. Elegans Zygote) haben maßgeblich bei der Festlegung der Grundsätze der polarisierten Zellteilung und anterior-posterioren Polarität und identifizierten kritischen membranassoziierten Polarität Determinanten (die kleinen GTPasen/CDC-42, die Partitionierung defekt PARs)^5,6, aber sie hängen von einzigartiger Symmetrie brechen Cues (Knospe Narbe, Sperma-Eintrag) und keine Kreuzung gesichert Apicobasal Membrandomänen und vermutlich die entsprechende intrazelluläre Apicobasal Maschinen sortieren. Unsere aktuelle Kenntnisse über die Organisation des Handels mit polarisierten Epithelien, setzt jedoch in erster Linie auf Säugetier-2D Monokulturen⁷, fehlen die physiologischen extrazellulären und Entwicklungsstörungen Hinweise, die Positionen der Membran ändern können Domains und Richtungen der Menschenhandel Trajektorien (Umstellung von 2D auf 3D in-vitro- Kultur-Systeme allein genügt, um die Membran Polarität in MDCK (Madin Darby canine Kidney) Zellen zu invertieren)⁸. In Vivo Studien von epithelialen Polarität bei Wirbellosen Modellorganismen verliefen zunächst in flachen Epithelien, zum Beispiel in der Epidermis von Drosophila Melanogaster , wo sie die kritischen Beitrag identifiziert der Kreuzung Dynamik für polarisierte Zellwanderung und Zelle Blatt Satz⁹und endocytic Handel für Polarität Wartung¹⁰. 3D in Vitro und in Vivo Analyse der Lumen Morphogenese in röhrenförmigen Epithelien in MDCK-Zellen und im Darm C. Elegans haben bzw. vor kurzem das Erfordernis der intrazellulären Handel zum de identifiziert Novo (apikalen) Domäne und Lumen Biogenese und Positionierung^11,12,13. Die Dicke der röhrenförmigen (im Gegensatz zu flach) Epithelzellen ist ein Vorteil für die 3D Analyse der subzellulären Asymmetrien da es eine überragende visuelle Unterscheidung der apikalen lumenal Membran, Apico-seitliche Abzweigungen, die seitlichen Membran ermöglicht und die Positionen der intrazellulären Organellen. Um diese visuellen Vorteile das C. Elegans Modell fügt in Vivo Einstellung, Entwicklungs-Achse, Transparenz, Einfachheit der Körper Plan, invariante und definierten Zelle Abstammung, analytische (genetische) und zusätzliche Vorteile beschrieben.

C. Elegans selbst ist ein Fadenwurm röhrenförmige Struktur, deren Transparenz und einfache Architektur ihre ebenso röhrenförmigen inneren Organe für die visuelle Analyse von Rohr- und Lumen Morphogenese direkt zugänglich machen. Die zwanzig Zellen der seinen Darm (21 oder 22 Zellen gelegentlich)¹⁴ stammen aus einer einzigen Stammvater Zelle (E) und entwickeln sich aus einem zweischichtigen Epithel durch Interkalation schrittweise in eine bilateral symmetrisch Tube neun INT Ringe (vier Zellen in der ersten Ring; Abbildung 1 schematische)^14,15,16. Den Darm Abstammung und Gewebe Analyse, zunächst bestimmt durch Nomarski Optik über nukleare Identitäten¹⁷und anschließend durch Fluoreszenz-Mikroskopie über beschriftete Membranen, lieferte wichtige Einblicke in die Morphogenese, in insbesondere die Zelle-autonome und Zelle-nichtautonomen Anforderungen für seine gerichtete Zellteilungen und Bewegungen (z.B.Interkalation, rechts-links-Asymmetrien, vordere und hintere Röhre Drehung)^14,18 . Frühe endodermische Zelle Spezifikation und Steuerung der Entwicklung dieses Organs klonalen Modell gen regulatorischen Netzwerk sind gut charakterisierten^19,20. Hier konzentriert sich jedoch auf die Analyse der polarisierten Membran und Lumen Biogenese in röhrenförmigen Einzelzellen und die intrazellulären Asymmetrien des Zytoskeletts Strukturen, Endomembranes und Organellen, die diesen Prozess begleiten. Die Analyse wird durch die Einfachheit dieses Rohres erleichtert, wo alle apikale Membranen (auf der Ultrastrukturforschung Ebene zeichnen sich durch Mikrovilli) Gesicht das Lumen und alle basalen Membranen stellen die äußeren Rohroberfläche mit seitlichen Membranen Kontakt mit einander, durch Kreuzungen von der apikalen Membran getrennt (Abbildung 1 Schaltplan; siehe Referenzen (^16,21) für C. Elegans-spezifische Organisation von engen und Adherens Junction Komponenten). Apikale Membran Biogenese ist also deckungsgleich mit Lumen Morphogenese. Darüber hinaus die Größe der Erwachsenen Darmzellen – die größten Zellen dieses kleinen Tieres (mit Ausnahme der Ausscheidungsorgane Zelle) – ungefähr die Größe einer Säugerzelle in Vivo visuelle Verfolgung der subzellulären Elemente, z. B. bei schönem Vesikel Bahnen, das ist in der Regel versucht in Vitro in der Kulturschale.

Für die Zwecke dieser Analyse zellulärer und subzellulärer ist eine entsprechende Kennzeichnung entscheidend. Intestinale Endo oder Plasmamembran Domänen, Kreuzungen, ZellskelettStrukturen, Kerne und andere subzellularen Organellen können visualisiert werden, indem Sie ihre spezifischen molekularen Komponenten beschriften. Viele dieser Komponenten wurden charakterisiert und entdeckt werden (Tabelle 1 zeigt ein paar Beispiele und bezieht sich auf Ressourcen). Beispielsweise wurden verschiedene Moleküle unterscheiden die röhrenförmigen und/oder vesikuläre Fächer des intestinalen Endomembrane Systems, von der ER, Golgi per Post-Golgi-Vesikel, die Plasmamembran identifizierten²². Die spezifische Proteine (sowie Lipide und Zucker) können entweder direkt oder indirekt beschriftet werden über verbindliche Proteine. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die in Situ Antikörper Färbung des festen Proben, einer der beiden standard-Kennzeichnung-Techniken (siehe begleitende Papier auf Ausscheidungsorgane Kanal Tubulogenesis für eine Beschreibung der anderen Technik² – Kennzeichnung in Vivo über fluoreszierende Protein Fusionen – die auf den Darm direkt anwendbar ist; Tabelle 2 enthält Beispiele für Darm-spezifische Promotoren, die verwendet werden können, Ausdruck von solchen Fusionsproteinen in den Darm zu fahren). Doppel- und mehrfache Beschriftung mit beiden Ansätzen oder mit einer Kombination aus beiden plus zusätzliche chemische Färbung, ermöglicht größere eingehende visuelle Auflösung und die Untersuchung der räumlichen und zeitlichen Veränderungen im Co Lokalisierung und Rekrutierung von spezifischen Moleküle oder subzelluläre Komponenten (Abbildung 2). Die Fixierung und Färbung in diesem Protokoll Unterstützung Erhaltung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Kennzeichnung während Immunostaining Verfahren beschriebene Verfahren. Für die Bildgebung, wichtige Punkte der Detektion und Charakterisierung von Phänotypen über mikroskopische Standardverfahren (sezierenden und konfokale Fluoreszenzmikroskopie) sind Tubulogenesis beschrieben ()Abbildung 3, 4). Dies können zu höheren Auflösung imaging Ansätze für Instanz Superresolution Mikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie (hier nicht beschrieben) erweitert werden.

Eine wesentliche Stärke dieses Systems ist die Fähigkeit, Polarität in einzelnen Zellen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien von Embryogenese bis ins Erwachsenenalter zu analysieren. Zum Beispiel kann apikale Membran Domain und Lumen Biogenese während der Entwicklung auf der Ebene der einzelligen nachverfolgt werden, über Etikettierung mit ERM-1, einer hoch konservierten Membran-Aktin-Linker der Ezrin-Radixin-Moesin Familie^23,24 . ERM-1 visualisiert apikale Membran Biogenese (1) während der embryonalen Rohr Morphogenese, tritt es begleitend mit polarisierten Zellteilung und Migration (Zellen bewegen, apikal Lumen während Interkalation)¹⁵; (2) während der späten embryonale und larvale Rohrverlängerung, die in der Abwesenheit von Zellteilung oder Migration verläuft; (3) in den Erwachsenen Darm, wo polarisierte Membrandomänen (Abbildung 1 bestehen). In der expandierenden Post-mitotische Larven Epithel, de Novo Membran polarisiert Biogenese kann somit von polarisierten Gewebe Morphogenese, die nicht in den meisten in Vivo und in Vitro epithelialen Polarität Modellen möglich ist, getrennt werden einschließlich derjenigen mit einzelligen Auflösung (z. B. die 3D MDCK Zyste Modell⁸). Mit Kennzeichnung für andere Komponenten, diese Einstellung bietet die Möglichkeit (vor allem bei den L1 Larvenstadium wenn Zellen einen höheren Anteil von Zytoplasma/Kern haben), die intrazellulären Veränderungen zu unterscheiden, die speziell für polarisiert Membran Biogenese ( z.B. die Neuausrichtung der Menschenhandel Trajektorien) von denen begleitend für polarisierte Zellteilung und Migration erforderlich.

Die genetische Vielfalt von C. Elegans ist bekannt²⁵und macht es ein leistungsfähiges Modell-System für die molekulare Analyse von biologischen Fragen. Eine Studie über die Morphogenese, kann zum Beispiel mit einem Wildtyp Stamm, eine transgene Sorte beginnen wo die Struktur von Interesse (z.B. eine Membran) mit einem fluoreszierenden Marker oder einen Verlust oder Gewinn-of-Function-Mutanten mit einem Defekt in diesem gekennzeichnet ist Struktur. Eine typische reverse genetische Studie kann eine Mutante, wo das gen des Interesses gelöscht wird, in die Keimbahn (z.B. durch eine gezielte Löschung), geändert durch Mutagenese (in der Regel produzieren Punktmutationen mit Verlust, Minderung oder Gewinn an Funktion generieren des Gens) oder wo seine Abschrift von RNAi reduziert. Die Leichtigkeit der RNAi durch Fütterung in C. Elegans²⁶ eignet sich auch für die Gestaltung der gezielten Bildschirme, die eine größere Gruppe von Genen von Interesse zu untersuchen. Eine genetische Modellorganismus wohl größte Stärke ist die Fähigkeit, in Vivo vorwärts Bildschirme (z.B. Mutagenese, systematische oder genomweiten RNAi-Bildschirme) durchzuführen, die eine unvoreingenommene Untersuchung über die molekulare Ursache für ein Phänotyp der erlauben Interesse. Zum Beispiel eine unvoreingenommene visuelle C. Elegans RNAi Tubulogenesis Bildschirm, beginnend mit einer transgenen Tieres mit ERM-1 benannt apikalen Membranen, entdeckte eine faszinierende reversible Darm Polarität Konvertierung und ektopische Lumen Phänotyp, verwendet hier als Beispiel für diese Art der Analyse. Dieser Bildschirm identifiziert die Erschöpfung der Glykosphingolipide (GSLs; obligat Membranlipide, über ihre GLS-biosynthetischen Enzyme identifiziert) und Bestandteile des Vesikels Mantel Clathrin und die AP-1-Adapter als die spezifischen molekularen Defekte verursachen diese Polarität Konvertierung Phänotyp, Queues dadurch charakterisieren diesen Menschenhandel Moleküle als in Vivo für die apikale Membran Polarität und Lumen Positionierung^12,13. Beim Starten mit einer bestimmten genetischen Mutation/Morphogenese Phänotyp können solche Bildschirme (oder einzelne genetische/RNAi Interaktion Experimente) auch funktionelle Interaktion zwischen zwei oder mehreren Genen von Interesse (siehe begleitende Papier auf die Ausscheidungsorgane untersuchen Kanal für ein Beispiel einer solchen Analyse)². Dieses Protokoll konzentriert sich auf RNAi bietet, neben seiner Fähigkeit, das Gen direkt zu identifizieren, deren Verlust den Phänotyp in vorwärts-Bildschirme, verursacht, spezifische Vorteile für die Analyse der Morphogenese. Da Genprodukte Regie Morphogenese oft in einer Dosis-abhängigen Weise arbeiten, ist RNAi in der Regel erfolgreich bei der Generierung ein Spektrum von Phänotypen. Die Möglichkeit, informative teilweise Verlustfunktion Phänotypen erzeugen hilft auch zur Behebung des Problems, dass die Mehrheit der wichtigen Tubulogenesis Gene entscheidend sind und dass ihre Verluste Sterilität und frühen embryonalen Tödlichkeit verursachen. Dieses Protokoll enthält bedingte RNAi-Strategien, um diese Schwierigkeit zu überwinden und zeigt Wege zu einer Generation von einem breiteren Spektrum von Phänotypen, wie z. B. ein Allel Serie von Mutagenese zu optimieren.