C. 선 충 장 한 모델으로 루멘 Morphogenesis 세포를 단일 세포 수준에서 Vivo에서 편광 막 속: 항 체 얼룩이 지기, RNAi 손실의 기능 분석 및 이미징 라벨

세포 및 subcellular asymmetries, 편광된 막 도메인의 형성 등의 세대 morphogenesis 및 셀, 조직 및 장기¹의 기능에 결정적 이다. 여러 연속과 일치 extracellular 및 세포내 신호는 의존 subcellular 구성 요소 할당에 방향 변경 이후 epithelia에 편광된 막 속에 대 한 연구 기술 도전 남아 어려운 대부분의 모델에서 분리 하 고 강하게 모델 시스템에 따라 달라 집니다. 모델은 여기에 제시-단일 층 꼬마 선 충 장-절묘 한 단순의 조직 이다. 단일 셀과 함께 배설 C. 선 충 ( C. 선 충 배설 운하에 편광된 막 속에 종이 동반 참조)²운하, 식별에 대 한 여러 독특한 이점을 제공 하 고 편광된 막 속에 필요한 분자 특성 이 간단한 무척 추 동물 기관 효 모에서 남자에 분자 극성 단서의 보존에 게 훌륭한“vivo에서 조직 챔버” 상피의 극성에도 아직까지 인간의 시스템에 직접적인 관련성 주소 질문에 복잡 한 단일 이러한 이벤트의 시각적 해 부를 허용을 세포 수준 비보.

비록 extracelluar 매트릭스 (1), (2) 플라즈마 멤브레인 교차점, 및 (3) 세포내 기공을 매매에서 여러 보존된 극성 신호 왔다 발견된³, 그들의 통합의 과정의 기본 원리 편광 된 상피 막과 조직 속에는 불완전 하 게 이해^4입니다. 클래식 단일 셀에 vivo에서 모델 (e.g.S. cerevisiae 와 선 충 C. zygote) 편광된 세포 분열 및 이전 후부 극성의 원칙을 정의 수단이 고 중요 한 식별 멤브레인 관련 극성 (작은 GTPases/CDC-42, 분할 결함 동위) 결정 요인^5,6, 하지만 그들은 신호 (버드 흉터, 정자 항목)을 깨는 독특한 대칭에 의존 하 고 접점 확보 부족 apicobasal 막 도메인 그리고, 아마도, 해당 세포내 apicobasal 기계를 정렬. 그러나 편광 epithelia, 매매의 조직에 대 한 우리의 현재 지식, 주로 의존 포유류 2D monocultures⁷는 막의 위치를 변경할 수 있는 세포 외 및 발달 생리 신호 부족 도메인 및 밀매 궤도의 방향 (혼자 문화 시스템 3 차원 생체 외에서 2D에서 스위치 MDCK (Madin-다 비 개 신장) 세포에서 막 극성 반전 충분)⁸. 무척 추 동물 모형 유기 체에서 상피 극성에 발달 학문 vivo에서 초파리 melanogaster 표 피, 그들은 중요 한 기여를 식별 하는 어디에 예를 들어 평면 epithelia에 처음 실시 했다 접합 역학 편광된 셀 마이그레이션 및 셀 시트 운동⁹, 그리고 극성 유지 보수¹⁰endocytic 인신 매매의. 3 차원 생체 외에서 및 MDCK 세포와 선 충 C. 소장 관 epithelia에 루멘 morphogenesis의 분석 vivo에서 각각 최근 확인 드에 대 한 세포내 매매의 요구 노 보 (꼭대기) 도메인 및 루멘 속^11,,1213위치. 두께의 (평면) 대 관 상피 세포는 subcellular asymmetries의 3D 분석에 대 한 장점 꼭대기 lumenal 막, apico-측면 접합, 측면 막의 뛰어난 시각적 구별 허용 이후와 세포내 세포의 위치입니다. 이러한 시각적 장점에 선 충 C. 모델에 비보 설정, 개발 축, 투명도, 몸 계획, 고정 및 정의 된 세포 계보, 분석의 단순 추가 (유전) 및 아래에 설명 된 추가 장점.

C. 선 충 자체는 관 구조 그의 투명성 및 간단한 건축 마찬가지로 관 내부 장기는 직접에 액세스할 수 있도록 튜브와 루멘 morphogenesis의 시각적 분석의 거 위. 그것의 창 (21 또는 22 셀에 경우에)¹⁴ 의 20 셀 단일 조상 셀 (E)에서 파생 된과 9 INT 반지의 양측 대칭 관으로 한 윤 단계 두 계층 상피에서 개발 (4 개의 세포는 첫 번째 링; 그림 1 도식)^14,,1516. 내장의 계보 및 조직 분석, 처음 결정 핵 정체성¹⁷통해 Nomarski 광학에 의해 이후에 의해 레이블이 막 통해 형광 현미경 검사 법에 자사의 morphogenesis에 중요 한 통찰력을 제공 하고있다 특정 방향 세포 분열 및 움직임 (예, 윤, 오른쪽 왼쪽 asymmetries, 앞쪽에 및 사후 관 회전)^{14,18 셀 자치 및 셀-비-자치 요구 사항} . 초기 endodermal 셀 사양 및 기관이 클론 모델의 개발을 제어 유전자 규제 네트워크 잘 특징이^19,20있습니다. 그러나 여기에,, 초점은 편광된 막과 단 관 세포의 루멘 속의 endomembranes, cytoskeletal 구조와이 과정을 동반 하는 세포의 세포내 asymmetries의 분석에 있습니다. 분석은 어디 (ultrastructural 수준에 microvilli로 구분) 모든 꼭대기 막 루멘 얼굴과 모든 기저 막 서로 연락 측면 멤브레인과 외부 튜브 표면, 얼굴,이 튜브의 단순에 의해 촉진 된다 접합 하 여 꼭대기 막에서 분리 (그림 1 회로도; C. 선 충에 대 한 참조 참조 (^16,21)-꽉의 특정 조직 및 외화 접합 구성 요소). 꼭대기 막 속은 이렇게 루멘 morphogenesis 일치 이다. 또한, 성인 장 세포-배설 셀의 예외) (와이 작은 동물의 가장 큰 셀-의 크기 대략 vivo에서 시각적 추적의 subcellular 요소, 예를 들면 허용, 포유류 세포의 크기 일반적으로 소포 궤적에 시도 생체 외에서 문화 접시에.

이 세포 및 subcellular 분석을 위해 적절 한 라벨링은 중요 합니다. 장 엔 또는 플라즈마 멤브레인 도메인, 접합, cytoskeletal구조, 핵 및 다른 subcellular 세포는 그들의 특정 분자 구성 요소에 라벨 하 여 구상 될 수 있다. 이러한 많은 구성 요소 특징 되었습니다와 발견 계속 (표 1 몇 가지 예제를 제공 하 고 리소스 참조). 예를 들어, 플라즈마 막에 포스트-골 지 소포를 통해 골을 응급실에서 장 endomembrane 시스템의 관 또는 기공을 구획을 구별 하는 다양 한 분자 식별된²²되었습니다. 특정 단백질 (로 지질과 당 분) 수 중 표시를 직접 또는 간접적으로 단백질 바인딩 통해. 이 프로토콜은 제자리에 고정된 표본, 두 표준 라벨 기법 중의 항 체 얼룩이에 초점을 맞추고 (동반 종이 대 한 설명은 다른 기술² -배설 운하 tubulogenesis에 참조 vivo에서 라벨 형광 성 단백질 융해-소장;에 직접 적용 되는 통해 테이블 2 소장 같은 융해 단백질의 표정 드라이브를 사용할 수 있는 내장 전용 발기인의 예를 제공 합니다). 더블-또는 어느 방식으로 또는 두 플러스 추가 화학, 얼룩이 지기의 조합으로 여러 라벨 수 큰 깊이 있는 영상 해상도 공동 지역화에 공간 및 시간적 변화의 시험 및 특정의 모집 분자 또는 subcellular 부품 (그림 2). 고정 하 고 녹색 형광 단백질 (GFP) immunostaining 절차 동안 라벨의이 프로토콜 지원 보존에 설명 된 절차를 얼룩. 이미징에 대 한 핵심 포인트는 검출 및 표준 현미경 절차 (형광 해 고 confocal 현미경 검사 법)를 통해 고기는 tubulogenesis의 (, 그림 3 4설명). 이러한 고해상도 이미징 인스턴스 해상도 현미경 검사 법 그리고 전송 전자 현미경 검사 법 (여기 설명)에 대 한 접근을 확장할 수 있습니다.

이 시스템의 주요 힘은 성인 기 통해 embryogenesis에서 다른 발달 단계에서 개별 셀에 극성을 분석 하는 능력 이다. 예를 들어, 꼭대기 막 도메인 및 루멘 속 추적할 수 있습니다 단일 세포 수준에서 개발에 걸쳐 음-1, Ezrin-Radixin-Moesin 가족^{23,24의 높은 보존된 막 걸 링커로 통해} . 음-1 때 수반 편광된 세포 분열 및 마이그레이션 (apically 윤 중 루멘 주위 세포 이동)¹⁵; 배아 튜브 morphogenesis, 동안 꼭대기 막 속 (1) 시각화 (2) 세포 분열 또는 마이그레이션;의 부재에서 진행 하는 늦은 배아와 애벌레 튜브 확장 중 (3) 편광된 막 도메인 (그림 1)을 유지은 성인 소장에서. 확장 포스트 mitotic 애벌레 상피에 드 노 보 편광 막 속 따라서 편광된 조직 morphogenesis 불가능 대부분 vivo에서 그리고 생체 외에서 상피 극성 모델에,에서 분리 될 수 있다 단일 셀 해상도 (예: 3D MDCK 낭종 모델⁸)에 그들을 포함 하 여. 다른 구성 요소에 대 한 라벨,이 설정은 제공 기회 (특히 L1 애벌레 단계에서 때 세포가 높은 세포질/핵 비율) 막 속 (편광에 관련 된 그 세포내 변화를 구별 하 예를 들어 밀매 궤적의 재교육) 수반 편광된 세포 분열 및 마이그레이션에 필요한에서.

C. 선 충 의 유전자 다양성은 잘 알려진²⁵그리고 생물학 질문의 분자 분석에 대 한 강력한 모델 시스템. Morphogenesis에 대 한 연구 예를 들어, 야생-타입 스트레인, 관심 (예: 막)의 구조 라는 형광 표시와 함께 또는이 결함 손실 또는 이득-의-기능 돌연변이와 유전자 변형 긴장을 시작할 수 있습니다. 구조입니다. 전형적인 역 유전자 연구 mutagenesis (일반적으로 생산 필연적인 손실, 감소, 또는 기능에 이득 포인트 돌연변이 의해 수정 (예: 대상된 삭제에 의해), 생식에 관심사의 유전자 삭제 돌연변이 생성할 수 있습니다. 유전자), 또는 그것의 사본을 RNAi에 의해 감소 된다. 먹이 선 충 C.²⁶ 에 의해 RNAi의 용이성 또한 관심사의 유전자의 큰 그룹을 검사 하는 대상 화면 디자인에 적용 됩니다. 유전자 모델 생물의 틀림 없이 가장 큰 힘이 이다 vivo에서 앞으로 화면 (예: mutagenesis, 체계적인 또는 게놈 넓은 RNAi 스크린)의 표현 형에 대 한 분자 원인으로 중 정한 조회를 수행 하는 기능 관심입니다. 예를 들어, 편견된 visual 유전자 변형 동물 꼭대기 막 음 1 표시와 함께 시작 하는 선 충 C. RNAi tubulogenesis 스크린, 발견 한 흥미로운 가역 장의 극성 변환 및 소성 루멘 형, 사용 분석의이 유형에 대 한 예로 여기. 이 화면이이 극성을 일으키는 특정 분자 결함으로 glycosphingolipids (GSLs; 의무 막 지질, 그들의 GLS 생 합성 효소를 통해 식별)의 고갈 및 소포 코트 clathrin와 그것의 AP-1 어댑터의 구성 요소 식별 변환 형, 따라서 vivo에서 으로 분자를 밀매 이러한 특성화 꼭대기 막 극성과 루멘^12,13위치에 대 한 단서. 같은 화면 (또는 단일 유전자/RNAi 상호 작용 실험) 수 관심 (참조 종이 배설에 동반의 두 개 또는 여러 개의 유전자 간의 상호 작용을 기능 검사 또한 특정 유전자 돌연변이/morphogenesis 표현 형으로 시작, 이 같은 분석의 예 운하)². 이 프로토콜은 RNAi는 직접 그 손실 앞으로 스크린에 표현 형을 하면 유전자를 식별 하는 능력 뿐만 아니라 morphogenesis의 분석에 대 한 구체적인 장점을 제공에 집중 한다. 종종 morphogenesis 감독 유전자 제품 복용량 의존 방식에서 작동, RNAi 이므로 일반적으로 고기의 스펙트럼을 생성에 성공. 유익한 부분 손실의 기능 고기를 생성 하는 기능 또한 중요 한 tubulogenesis 유전자의 대다수는 필수 고 그들의 손실을 불 임의 원인과 초기 배아 치 사 율 그 문제를 해결 하기 위해 도움이 됩니다. 이 프로토콜이이 어려움을 극복 하기 위해 조건부 RNAi 전략을 포함 하 고 고기, mutagenesis에 의해 생산 하는 유전자 시리즈의 광범위 한 스펙트럼의 생성을 최적화 하는 방법을 제안.