Summary

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Published: September 28, 2017
doi:

Summary

Descreveremos um protocolo para identificar proteínas RNA-obrigatórias e mapear suas regiões de ligação de RNA em células vivas, usando photocrosslinking UV-mediada e espectrometria de massa.

Abstract

RNA não-codificante desempenham papéis importantes em diversos processos nucleares, incluindo a regulação da expressão gênica, estrutura da cromatina e reparação do DNA. Na maioria dos casos, a ação de RNA não-codificante é mediada por proteínas que por sua vez, cujas funções são regulamentadas por essas interações com RNA não-codificante. Consistente com este, um número crescente de proteínas envolvidas em funções nucleares têm sido relatado para vincular o RNA e em alguns casos as regiões de RNA-ligação destas proteínas foram mapeadas, muitas vezes através de métodos laboriosos, baseado no candidato.

Aqui, nós relatamos um protocolo detalhado para realizar uma identificação imparcial elevado-throughput, proteoma-largo de RNA-proteínas e suas regiões de RNA-obrigatórias. A metodologia baseia-se na incorporação de uma uridina fotorreativas analógica no RNA celular, seguido de reticulação de RNA-proteína mediada por UV e análises de espectrometria de massa para revelar o RNA-quitosana péptidos dentro do proteoma. Embora nós descrevemos o procedimento para as células estaminais embrionárias de rato, o protocolo deve ser facilmente adaptado a uma variedade de culturas de células.

Introduction

O objetivo do método RBR-ID é identificar novas proteínas RNA-obrigatórias (RBPs) e mapear as regiões de RNA-obrigatórias (RBRs) com resolução de peptídeo-nível para facilitar o design de mutantes de RNA-obrigatórias e a investigação da biológicas e bioquímicas funções de interações proteína-RNA.

O RNA é único entre biomoléculas pode atuar como um mensageiro carregando informação genética e também dobrar em estruturas tridimensionais complexas com funções bioquímicas mais parecidas com as de proteínas1,2. Um corpo crescente de evidências sugere que o RNA não-codificante (ncRNAs) desempenhar um papel importante em diversos genes vias regulamentares e epigenéticas3,4,5 e, normalmente, essas funções reguladoras são mediadas em concerto com proteínas que interagem especificamente com um determinado RNA. De particular importância, um conjunto de proteínas de interação foi recentemente identificado para o ncRNA longo intensamente estudada (lncRNA) Xist, fornecendo insights valiosos sobre como este lncRNA Medeia a inativação do cromossomo x em células femininas6,7 ,8. Notavelmente, várias destas proteínas Xist-interagindo não contêm qualquer de domínios de RNA-ligação canônica9, e, portanto, sua atividade RNA-ligação não poderia ser previsto em silico com base em sua sequência primária sozinha. Considerando que milhares de lncRNAs são expressos em qualquer determinada célula10, é razoável supor que muitos deles podem agir através de interações com o ainda a ser descoberto proteínas RNA-obrigatórias (RBPs). Uma estratégia experimental para identificar essas novela RBPs, portanto, iria facilitar grandemente a tarefa de dissecar a função biológica de ncRNAs.

Tentativas anteriores para identificar RBPs empiricamente têm invocado polyA + RNA seleção acoplada a espectrometria de massa (MS)11,12,13,14,15. Embora estas experiências adicionado muitas proteínas à lista do RBPs putativos, por design, que só podiam detectar proteínas vinculadas a polyadenylated transcrições. No entanto, a maioria dos RNAs pequeno e muitos lncRNAs não são polyadenylated. 16 , 17 e suas proteínas de interação teria provavelmente sido perdidas nesses experimentos. Um estudo recente da proteína-proteína interactome bancos de dados para identificar as proteínas que co purificado com vários conhecidos RBPs e mostraram que esses parceiros RBP recorrentes eram mais prováveis de possuir RNA-obrigatórias atividades18aplicada aprendizado de máquina. No entanto, essa abordagem baseia-se na mineração de bancos de dados existentes de grande interação e só podemos identificar as proteínas que podem ser co purificadas em condições não-desnaturação com conhecidos RBPs, excluindo assim a partir da análise, insolúvel, membrana-incorporado e escassa proteínas.

A identificação de uma proteína como uma bona fide RBP muitas vezes não produz automaticamente informações sobre a função biológica e/ou bioquímica da interação da proteína-RNA. Para resolver este ponto, é geralmente desejável para identificar os proteína domínio amino-ácido resíduos e envolvidos na interação, para que os mutantes específicos podem ser projetados para testar a função de ligação de RNA no contexto de cada novela RBP19, 20. esforços anteriores do nosso grupo e outros usaram fragmentos de proteína recombinante e exclusão mutantes para identificar RNA vinculação regiões (RBRs)19,20,21,22; no entanto, tais abordagens são trabalhosas e incompatível com as análises de alta produtividade. Mais recentemente, um estudo descreveu uma estratégia experimental para mapear as atividades de RNA-obrigatórias em uma moda de alta produtividade usando espectrometria de massa23; no entanto, esta abordagem baseou-se em uma seleção duplo polyA + RNA e assim, carregava as mesmas limitações que as abordagens de identificação RBP descritas acima.

Desenvolvemos uma técnica, denominada RNA vinculação região identificação (RBR-ID), que explora a proteína-RNA photocrosslinking e espectrometria de massa quantitativa para identificar proteínas e regiões da proteína interagindo com RNA em células vivas sem fazer suposição sobre o estatuto de poliadenilação RNA, incluindo assim RBPs vinculado a polyA-RNAs24. Além disso, esse método depende exclusivamente de reticulação e tem sem requisitos na solubilidade de proteínas ou acessibilidade e, portanto, é adequado para mapear as atividades de RNA-obrigatórias dentro membranas (por exemplo, o envelope nuclear) ou compartimentos pouco solúvel ( por exemplo, a matriz nuclear). Descrevemos as etapas experimentais para executar RBR-ID para os núcleos de células estaminais embrionárias de rato (mESCs), mas com pequenas modificações este protocolo deve ser apropriado para uma variedade de tipos de células, desde que eles eficientemente podem incorporar 4SU da cultura médio.

Protocol

1. cultura e expansão de mESCs Nota: as células estaminais embrionárias de rato são fáceis de cultura e pode ser expandidas rapidamente para os grandes números exigidos pelo bioquímicas experiências graças a seu tempo de ciclagem rápida. MESCs saudáveis dobrar a cada 12 h. MESCs expandir para o número desejado em placas gelatinizadas no mESC médio (veja abaixo) em uma incubadora de cultura de tecidos mantido a 37 ° C, 5% de CO 2, e > 95% de umidade. <br…

Representative Results

A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho RBR-ID. Devido a reticulação relativamente baixa eficiência dessa técnica, é muito importante levar em consideração tanto a nível de esgotamento e a consistência do efeito observado (P -valor) através de réplicas biológicas. A Figura 2 mostra uma trama de vulcão de resultado RBR-ID. Peptídeos que sobrepostas domínio de motivo (RRM) de reconhecimento de RNA mostram nív…

Discussion

Descreveremos um protocolo experimental pormenorizado para executar RBR-ID em mESCs e, com modificações apropriadas, em qualquer célula que pode incorporar 4SU em RNA. Outros tipos de células podem exigir a otimização da abordagem para garantir um suficiente sinal à relação de ruído. Além disso, enquanto o protocolo descrito neste documento concentra-se no exame do RBPs nucleares, a tecnologia de RBR-ID deve ser facilmente adaptada para diferentes compartimentos celulares, como o citoplasma ou organelas espec?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R.B. foi apoiada pelo programa de estudiosos de Searle, Fundação Smith W.W. (C1404) e a marcha de Dimes Foundation (1-FY-15-344). B.A.G reconhece que o apoio do NIH concede R01GM110174 e NIH R01AI118891, bem como DOD conceder BC123187P1. R.W. ‘-T. foi apoiada pelo subsídio de formação de NIH T32GM008216.

Materials

KnockOut DMEM Fisher Scientific 10829018
Fetal bovine serum, qualified, US origin Fisher Scientific 26140079
L-Glutamine solution 200 mM Sigma G7513
Penicillin-Streptomycin solution Sigma P0781
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) Sigma M7145
2-Mercaptoethanol Sigma M3148
ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) EMD Millipore ESG1106
CHIR99021 Tocris 4423
PD0325901 Sigma PZ0162
Gelatin solution,2% in water Sigma G1393
4-thiouridine Sigma T4509 50 mM stock in water
Spectrolinker XL-1500 Fisher Scientific 11-992-90
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma 78830
IGEPAL CO-630 Sigma 542334 Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent
Iodoacetamide Sigma I6125
Trypsin, sequencing grade Promega V5111
Empore solid phase extraction disk 3M 66883
OLIGO R3 Reversed – Phase Resin Fisher Scientific 1133903
Benzonase Sigma E8263 High purity nuclease
Sonic Dismembrator Model 100 Fisher Scientific discontinued updated with FB505110
HPLC grade acetonitrile Fisher Chemical A955-4
HPLC grade water Fisher Scientific W6 4
TFA Fisher Scientific A11650
Ammonium Bicarbonate Sigma A6141
Acetic Acid Sigma 49199
Formic Acid Sigma F0507
ReproSil-Pur 18-AQ Dr. Maisch GmbH HPLC r13.aq.0003 Packing material for HPLC column
Capillary for nano columns (75 µm) Molex 1068150017
MaxQuant software Max Planck Institute for Biochemistry Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs

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Cite This Article
Warneford-Thomson, R., He, C., Sidoli, S., Garcia, B. A., Bonasio, R. Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions. J. Vis. Exp. (127), e56004, doi:10.3791/56004 (2017).

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