אנו מציגים שיטה לכימות פנוטיפים הצמיחה של תאים שמרים בודדים כפי שהם גדלים לתוך מושבות על מדיה מוצקה באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ בשם, אחת הכפלה הערכה של מערכים חיים של שמרים (ODELAY). הטרוגניות האוכלוסייה של תאים זהים גנטית גדל לתוך מושבות ניתן לצפות ישירות לכמת.
פנוטיפים גדילה של מיקרואורגניזמים הם אינדיקטור חזק של הכושר הגנטי הבסיסי שלהם וניתן להפריד בין 3 משטרי צמיחה: שלב בפיגור, שלב שלב, שלב נייח. כל שלב גדילה יכול לגלות היבטים שונים של כושר הקשורים לתנאים סביבתיים וגנטיים שונים. מדידות ברזולוציה גבוהה וכמותית של כל 3 שלבי הצמיחה הם בדרך כלל קשה להשיג. כאן אנו מציגים שיטה מפורטת לאפיין את כל השלבים 3 צמיחה על מדיה מוצקה באמצעות assay שנקרא תא בודד הכפלת הערכה של מערכים חיים של שמרים (ODELAY). ODLAY מכמת פנוטיפים הצמיחה של תאים בודדים גדל מושבות על מדיה מוצקה באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ. שיטה זו יכולה ישירות לבחון את ההטרוגניות האוכלוסייה עם כל פרמטר הצמיחה בתאים זהים גנטית גדל מושבות. הטרוגניות אוכלוסייה זו מציעה נקודת מבט ייחודית להבנת רגולציה גנטית ואפיגנטית ותגובותהפרעות גנטיות וסביבתיות. בעוד שיטת ODLAY מודגם באמצעות שמרים, זה יכול להיות מנוצל על כל המושבה היוצרים מיקרואורגניזם זה גלוי על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר.
פנוטיפים גדילה של מיקרואורגניזמים הם אינדיקציה חזקה של הכושר הגנטי הבסיסי שלהם למצב סביבתי נתון. הצמיחה מופרדת באופן קלאסי לשלושה משטרי צמיחה שונים: שלב השלב, שלב הפאזה וצמיחת פאזה נייחת 1 . כל שלב גדילה יכול לגלות היבטים שונים של כושר התלויים בתנאים סביבתיים וגנטיים שונים. לדוגמה, זמן השהיה, או משך הזמן האורגניזם מבלה בשלב השהיה לפני תחילת הצמיחה מעריכי, יכול להצביע על יכולתו של אורגניזם להגיב לתנאים סביבתיים שונו 2 . הכפלת זמן הגידול במהלך שלב הפלט, המדד הנפוץ ביותר של כושר הסלולר, מגלה את היעילות הכוללת של יכולתו של אורגניזם לחלק על ידי חילוף החומרים ושימוש בחומרים סביבתיים לשכפול. שלב נייחים, שבו הצמיחה לאחר שלב יומן מופחת במהירות, הוא אינדיקטור נוסף של כושר, שהוא קבועLy משמש נקודת סיום הצמיחה במקום מבוססי מבחני שמרים צמיחה.
כמה שמרים צמיחה שמרים זמינים כיום נחשב שיטות סטנדרטיות להערכת פנוטיפים הצמיחה בשמרים 3 , 4 , 5 . מבחני אלה מבוססים בעיקר על שיטות גידול שמרים או על מוצק או בתקשורת נוזלית. על מוצק התקשורת, המושבה להצמיד מבחני להעביר מספר קטן של תאים על גבי אגר מוצק עם סיכה, תאים שמרים מותר לגדול לתקופה מוגדרת של זמן. המושבות הם צילמו ואז הגודל שלהם מושווים בנקודת קצה מסוף 6 . אלה מושבות pinning המושבה הוכיחו חזקים וניתן להרחבה כדי ליצור מסך רחב הגנום. לאחרונה, הדמיה תקופתית באמצעות סורקים שטוחה שטוח עדשות יחיד רפלקס (SLR) מצלמות שולבו אלה מבחני להקליט צמיחה המושבה לאורך זמן 7 , 8, 9 . עם זאת, הפתרון של התקנים אלה מונע מהם לגלות תאים בודדים ולכן, אלה מושבות הצמיד המושבה לא ישירות לצפות בפיגור זמן ולא ניתן להבחין וריאציה בין תאים בודדים לגדול לתוך מושבות.
מבחני צמיחה מבוססי נוזלים הועסקו גם כדי לבצע מסכי גנום רחבים 3 . צימוד assay צמיחה נוזלית עם מיקרוסקופ זמן לשגות חשף ההטרוגניות האוכלוסייה בזמן הכפלת תאים בודדים זהים גנטית, אשר מציעה נקודת מבט חשובה להבנת רגולציה גנטית הסתגלות סביבתית. עם זאת, assay זה אינו מודד היבטים אחרים של צמיחה כגון זמן השהיה כושר נשיאה 10 . כאן אנו מציגים שיטה לאפיין את כל שלבי הצמיחה של המושבה להרכיב מיקרואורגניזמים על מדיה מוצקה באמצעות assay אנחנו מונח ODELAY 11 . ODELAY מורכב utiliZing גבוהה התפוקה זמן לשגות מיקרוסקופ כדי להקליט תמונות של תאים בודדים גדל לתוך מושבות על מוצק התקשורת. אוכלוסייה זו של תאים בודדים הגדלים לתוך מושבות מגלה את ההטרוגניות הבסיסית של האוכלוסייה, אשר לא זוהה על ידי מדידות פחות רגישות אחרות כגון ניקוד נקודות קצה סופיות. אנו מדגימים את השיטה על שמרים, אבל ODELAY ניתן להחיל על כל אורגניזם זה מראה בניגוד מיקרוסקופ שדה בהיר.
Assay ODLAY יש כמה נקודות קריטיות להבטחת המדידות פנוטיפי לשחזור ואמין. הנקודה הקריטית הראשונה היא הכנה עקבית של תרבויות השמרים. יש להקפיד לקצור את תאי השמרים מן הצמיחה הלוגריתמית. אם תרבויות יש רווי, אז ההטרוגניות האוכלוסייה שלהם יהיה מוגבר אשר עלול לערפל הטרוגניות הנגרמת על ידי גורמים גנטיים או סביבתיים ( למשל, מקור פחמן) 11 . הנקודה הקריטית השנייה היא הכנה עקבית של התקשורת. באופן כללי, נפח גדול של פתרון 10X מדיה מלאי צריך להיות שנוצר ולאחר מכן נעשה שימוש לאורך זמן כדי למזער את האפקטים אצווה. גיבוש מדיה לפי משקל, ככל הניתן, מסייע לשפר את עקביות המדיום לאורך זמן על ידי הבטחת צפיפות של אגר ואת התוכן הכולל של המים של agarose ניתן לפקח מקרוב. הנקודה הקריטית השלישית כוללת מזעור או ביטול כל דפורמציה מכנית של agarose אותי. דפורמציה מכנית של התקשורת תהיה הנפוצה ביותר להתרחש במהלך ההפרדה של agarose מן שקופיות הזכוכית. כמו טכניקות מעבדה רבות, בפועל נדרש לשלוט בשלב זה.
שינוי בזמן בפיגור כפי שמתואר באיור 4 , קשורה לעיתים קרובות לאחד משלושת הגורמים: עיוות מכני של המדיום agarose, וריאציה בעובי אגר מעוצב, או מקור אור יציב. אם המדיום agarose משתנה Z- גובה על פני מערך מנומר, וריאציה גובה עלול להציף את טווח של שגרת פוקוס אוטומטי, גורם לתמונות הראשונית להיות קצת מחוץ להתמקד. מסיבה זו, לבדוק את גובה המיקוד במספר כתמים במרכז לאורך הקצוות של מערך הבחין כדי להבטיח את שגרת פוקוס אוטומטי יש מספיק טווח Z כדי למצוא את המיקוד. אם יש צורך, השתמש בחלונית 'פוקוס אוטומטי' כדי להגדיל את טווח המיקוד ולהגדיל את מספר שלבי המיקוד.
קונדיט שלישי אפשרייון שעלול להוביל להתמקדות ירודה הוא מקור אור לא יציב או מהבהב, אשר יכול לשבש את ציון המיקוד מחושב עבור Z- גובה מסוים. נורות הלוגן טונגסטן נוטים להבהב הרבה לפני הנורות לשרוף. ההשפעה של המיקוד לקוי הוא ציין בדוגמה אחת שבה עקומות הצמיחה לטבול בין הראשון והשני נקודות זמן ( איור 5 א ), ואילו במקום הסמוך אין לטבול אותו ( איור 5 ב ' ). במקרה זה, מצב המיקוד המסכן הוקל על ידי החלפת מקור האור הלוגן טונגסטן.
בפועל, המחברים מצאו כי כדי להפחית את הבהוב של 100W טונגסטן נורות הלוגן, הנורות צריך להיות מוחלף כל 500 שעות או בערך כל 2 חודשים כאשר המיקרוסקופים נמצאים תחת שימוש כבד. כדי למנוע בעיות מיקוד ירודות מנורה מהבהבת, החלף את מקור האור של הלוגן טונגסטן לעיתים קרובות או החלף את נורת ההלוגן באמצעות מקור אור דיודה. Anדוגמא למערך המציג וריאציה נמוכה בזמני ההכפלה וכן זמני פיגור אחידים יותר מוצגים באיור 6 . מערך נתונים זה נלקח עם דיודה מאיר אשר מספק תאורה יציבה יותר לאורך זמן תוך ביצוע פוקוס אוטומטי.
בעוד שרבים מהנקודות שהוזכרו כאן לאופטימיזציה של הכנת המדיה עשויות להיות מובנות מאליהן, בספרות המסכים הגדולים ביותר לא משכפלים היטב זה עם זה 8 , 11 . לכן, יש לנו תיאר בקפידה את ההכנה של תרבויות התקשורת agarose כך מסכי פנוטיפי לשחזור יותר עשוי להיווצר.
Assay ODLAY מוגבל כעת התפוקה בהשוואה להצמדת מבחני מבוסס כגון מערכים גנטיים סינתטיים או assay Scan-O-Matic. בעוד שיטות אלה להגדיל את מספר זנים נמדדים, הם חסרים יכולת לפתור תאים בודדים אNd ולכן לא ניתן למדוד הטרוגניות האוכלוסייה שאנו רואים בתוך זנים שמרים משובטים. מקור ההטרוגניות של אוכלוסייה זו אינו מובנת כיום, אך מיזוג הטכנולוגיה והחישוב כפי שמוצג כאן מציע הזדמנות להתייחסות אובייקטיבית למנגנונים הסלולאריים הבסיסיים 12 .
המחברים מבקשים לציין כי ODELAY כרגע מותאם רק עבור מותג מיקרוסקופ מסוים סוג הגוף. שינוי ODLAY עבור מערכות מיקרוסקופ אחרות הוא ישר קדימה אבל ידרוש ידע של קוד פתוח 13 API. עם זאת, הן ה- API, כמו גם את הסקריפטים ODELAY כתובים להיות מותאמים בקלות למערכות שונות מבחני ניסיוני.
בעוד ODELAY פותחה במקור עבור שמרים, היינו מסוגלים לנצל את זה ללא שינוי כדי לבחון את הצמיחה של Mycobacterium smegmatis . תצפית של המושבה האחרת להרכיב מיקרואורגניזמים הואאפשרי עם שינויים בקוד המקור שסופק 11 . באופן כללי, ODELAY הוא כלי רב עוצמה וגמיש להשוואת מיקרואורגניזמים הגדלים בתנאים סביבתיים שונים הפרעות גנטיות.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מאשרים תמיכה עבור עבודה זו על ידי מענקים U54 RR022220 ו P50 GM076547 ל- JDA מהמכון הלאומי האמריקני לבריאות. FDM הוא פוסט דוקטורט עם המכון הקנדי לחקר הבריאות. אנו מודים גם למרכז לוקסמבורג למערכות ביו-רפואה ולאוניברסיטת לוקסמבורג לתמיכה.
Agarose UltraPure | ThermoFisher | 16500500 | Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2g/sq cm |
Yeast Extract Peptone (YEP) | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
Complete Suplement Mixture (CSM) | Fisher Scientific | MP114560222 | |
Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700) | SigmaAldrich | P2906 | |
Yeast Strain BY4741 | ThermoFisher | 95400.BY4741 | |
Yeast Strain BY4742 | ThermoFisher | 95400.BY4742 | |
50mL Falcon tubes | Corning | 430291 | 1 case |
15mL Falcon tubes | Corning | 352096 | |
2 x 3 inch 1.0mm thick slides 1/2 gross | VWR | 48382-179 | |
96 well plate flat bottom | Corning | 353072 | |
Hydra liquid handleing robot | Thermo | 1096-DT-100 | |
Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot | Hamilton | ||
hydra 100 mL tips Extended Length DARTS | Thermo | 5527 | |
Synergy H4 Plate Reader | Biotek | H4MLFAD | |
Leica DMI6000 B Microscope | Leica | ||
Leica 10X/0.3NA objective | Leica | 11506289 | |
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera | Hamamatsu | C11440-22CU | |
MATLAB with image processing tool box | Mathworks | ||
MicroManager | Open Imaging | https://micro-manager.org/ | |
ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI) | www.aitchisonlab.comODELAY for Matlab scripts and software | ||
ODELAY Microscope Chamber | www.aitchisonlab.comODELAY for Mechanincal Drawings | ||
ODELAY Agar Molds | www.aitchisonlab.comODELAY for mold drawings |