Sinaptik vezikül endositoz kültürlü Hipokampal nöronlar içinde ölçme
Summary
Sinaptik vezikül endositoz sinaptik vezikül protein ile erimiş pHluorin ışık mikroskobu ve elektron mikroskobu vezikül Alım tarafından algılanır.
Abstract
Endositoz sırasında erimiş sinaptik veziküller vezikül geri dönüşüm ve böylece sinaptik iletimi sırasında tekrarlayan sinir ateş bakım sağlayan sinir terminallerinde alınır. Patolojik durumlarda Engelli endositoz sinaptik gücü ve beyin fonksiyonları düşüşler yol açar. Burada, sinaptik vezikül endositoz memeli Hipokampal synapse nöronal kültür, ölçmek için kullanılan yöntemleri açıklar. Sinaptik vezikül protein endositoz veziküler lumenal yan pHluorin, artar bir pH duyarlı yeşil flüoresan protein ile synaptophysin ve VAMP2/synaptobrevin, dahil olmak üzere bir sinaptik veziküler membran protein eritme tarafından izlenen onun pH olarak floresan yoğunluğu artar. Ekzositozu sırasında veziküler Lümen pH artırır, veziküler endositoz Lümen sırasında pH yeniden acidified ise. Endositoz etiketli sinaptik vezikül protein bir azalma gösterir, ancak böylece, fusion, pHluorin floresan yoğunluğu bir artış gösterir. Endositoz kaydetmek için pHluorin görüntüleme yöntemi kullanmaya ek olarak, biz membran veziküler endositoz Horseradish peroksidaz (HRP) Alım elektron mikroskobu (EM) ölçümleri tarafından veziküller tarafından izlenir. Son olarak, yüksek potasyum kaynaklı depolarizasyon sonra çeşitli zamanlarda sinir terminal membran çukurlar oluşumu izlenir. HRP alımı ve membran çukur oluşumu zaman tabii endositoz zaman elbette gösterir.
Introduction
Nörotransmitter sinaptik veziküller içinde depolanan ve ekzositozu tarafından yayımlanan. Sinaptik vezikül membran ve protein o zaman endositoz tarafından içselleştirilmiş ve ekzositozu sonraki turda yeniden. Sinaptik veziküller endositoz sinaptik vezikül havuzları korumak için önemlidir ve çıkıntılı veziküller plazma zarı kaldırır. Asidik şartlar altında su ve nötr pH dequenched, pH-duyarlı yeşil flüoresan protein pHluorin derslerde hücreleri1,2,3canlı endositoz zamanı ölçmek için kullanılmaktadır. PHluorin protein genellikle sinaptik vezikül proteinler, synaptophysin veya VAMP2/synaptobrevin gibi lumenal tarafına eklenir. İstirahat, sinaptik veziküller 5,5 pH Lümen içinde pHluorin söndürülür. Plazma zarı vezikül fusion sunar veziküler Lümen ekstraselüler çözüm pH ~ 7.3, nerede bir artış pHluorin floresan kaynaklanan. Ekzositozu sonra artan Floresans bozunmaları, endositoz vezikül yeniden asitleştirme kurtarılan Bu veziküller içinde ardından sinaptik vezikül proteinlerin nedeniyle. Endositoz ve veziküler yeniden asitleştirme çürüme yansıtan rağmen yeniden asitleştirme endositoz çoğu koşulları1,4daha hızlı olduğu için çoğunlukla endositoz, yansıtır. 3-4 s veya genellikle daha hızlı 10’dan daha az5,olan6, yeniden asitleştirme zaman sabiti olan s veya daha vezikül endositoz4,5için gerekli. Deneyler endositoz yeniden asitleştirme ayırt etmek gerekiyorsa, pH 5.5 ile 4-Morpholineethanesulfonic asit (MES) çözüm (25 mM) kullanarak asit su verme deneyleri sinaptik vezikül proteinler alınır olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir endositoz1,3,4üzerinden plazma zarı. Böylece, pHluorin floresan yoğunluk artmak exo – ve endositoz bir denge yansıtır ve sinir stimülasyonu sonra düşüş özellikle endositoz yansıtır.
pHluorin görüntüleme sadece endositoz zaman tabii, aynı zamanda sinaptik vezikül havuzları7,8boyutunu ölçmek için kullanılabilir ve olasılık uyarılmış yayın ve spontan bırakın9. Birçok faktörler ve proteinler endositoz, kalsiyum, çözünür NSF-ek protein reseptörü (tuzak) proteinler, beyin kaynaklı Nörotrofik factor(BDNF) ve kalsinörin gibi düzenlenmesinde ilgili pHluorin görüntüleme1 kullanarak belirlendi , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. Ayrıca, nörotransmitter sürümü yalnızca birincil nöronlar ama Nöroblastom hücreleri TIRFM17ile tespit edilemedi. Son zamanlarda, pHluorin türevleri, dsRed, mOrange ve pHTomato bir tek synapse18,19Multipl faktörler eşzamanlı kayıtları izlemek için geliştirilmiştir. Örneğin, pHTomato synaptophysin ile erimiş edilmiş ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesiyle (GCaMP5K) presynaptic vezikül fusion ve Ca2 + akını postsinaptik yuvası20izlemek için kullanılır. Bu nedenle, sinaptik proteinler için bağlı pHluorin ekzositozu endositoz arasındaki ilişkiyi analiz etmek için yararlı bir yöntem sağlar.
EM endositoz ultrastructural değişiklikleri sırasında endositoz gösterir yüksek Uzaysal çözünürlük nedeniyle çalışma için yaygın olarak kullanılan başka bir yöntemdir. İki genel patolojik değişiklikler nöronal hücre21 içinde görselleştirmek ve vezikül proteinler22takip yeteneği alanlardır. Özellikle, clathrin periactive bölgesinde tarafından gözlem sinaptik vezikül Alım, membran eğriliği kaplı ve endosomal yapıları EM3,23,24ile,25 mümkündür ,26,27,28. Bu endositoz etkileyebilir EM malformasyonlar, sabitleştirici indüklenen gibi potansiyel yapılar içerir ve veri analizidir emek yoğun, çözünürlük hücresel yapısı görselleştirmek için cazip bir fırsat sağlar. Olası sabitleştirici sorunları ve EM zamansal çözünürlük sınırlaması dondurma, hassas yapıları endositoz27sırasında mevcut sabitleme hızlı ve kimyasal olmayan bir yöntem sağlayan yüksek basınç tarafından üstesinden gelebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada biz sinaptik vezikül endositoz izlemek için iki yöntem göstermek. İlk yöntemde, bir sinaptik vezikül protein transfected nöronlar içinde erimiş ve sonradan ortaya çıkan elektriksel olarak uyarılmış pHluorin izlenir. İkinci olarak, biz EM görüntüleme HRP Alım KCl tarafından indüklenen olarak kullanılır. Biz iki nedenden dolayı farklı uyaranlara kullanılır. İlk olarak, yüksek potasyum uygulaması depolarizasyon kültür bütün nöronların neden olmaktadır. EM metodolojimiz sigara uya…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Yong-Ling Zhu synaptophysin pHluorin2x yapı ve Dr James E. Rothman VAMP2-phluorin sağlamak için verdiğiniz için teşekkür ederiz. Biz Dr Susan Cheng ve Virginia Crocker NINDS elektron mikroskobu tesisin kendi teknik destek ve yardım için teşekkür ederiz. Bu eser sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve kontur Intramural araştırma programının ABD ve bir hibe programından KRIBB araştırma girişimi (Korece biyomedikal bilim adamı Fellowship programı) Kore Araştırma Enstitüsü tarafından desteklenen Bioscience ve biyoteknoloji, Kore.
Materials
| Lipofectamine LTX with Plus | Thermo Fisher | 15338-100 | Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin |
| neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | Growth medium for neuron, Warm up to 37°C before use |
| B27 | Thermo Fisher | 17504-044 | Gradient for neuronal differentiation |
| Glutamax | Thermo Fisher | 35050-061 | Gradient for neuronal culture |
| Poly-D-Lysine coated coverslip | Neuvitro | GG-25-pdl | Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin |
| Trypsin XI from bovine pancrease | Sigma | T1005 | Neuronal culture-digest hippocampal tissues |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 | Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension |
| pulse stimulator | A-M systems | model 2100 | Apply electrical stimulation |
| Slotted bath with field stimulation | Warner Instruments | RC-21BRFS | Apply electrical stimulation |
| stimulus isolation unit | Warner Instruments | SIU102 | Apply electrical stimulation |
| lubricant | Dow corning | 111 | pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber |
| AP5 | Tocris | 3693 | Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
| CNQX | Tocris | 190 | Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
| Illuminator | Nikon | C-HGFI | Metal halide light source for pHluorin |
| EMCCD camera | Andor | iXon3 | pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity |
| Inverted microscopy | Nikon | Ti-E | Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells |
| NIS-Elements AR | Nikon | NIS-Elements Advanced Research | Software for imaging acquisition and analysis |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for imaging analysis and data presentation |
| imaging chamber | Warner Instruments | RC21B | pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells |
| poly-l-lysine | Sigma | P4832 | Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times |
| Horseradish peroxidase(HRP) | Sigma | P6782 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use |
| Na cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N |
| 3,3′-Diaminobenzidine(DAB) | Sigma | D8001 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16365 | Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use |
| TEM | JEOL | 200CX | Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes |
| CCD digital camera | AMT | XR-100 | Electron microscopy, capturing images |
| Lead citrate | Leica microsystems | 16707235 | Electron microscopy, grid staining |
References
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nature cell biol. 2 (4), 197-204 (2000).
- Sun, T., Wu, X. S., et al. The role of calcium/calmodulin-activated calcineurin in rapid and slow endocytosis at central synapses. J Neurosci. 30 (35), 11838-11847 (2010).
- Wu, X. -. S. S., Lee, S. H., et al. Actin Is Crucial for All Kinetically Distinguishable Forms of Endocytosis at Synapses. Neuron. 92 (5), 1020-1035 (2016).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).
- Atluri, P. P., Ryan, T. A. The kinetics of synaptic vesicle reacidification at hippocampal nerve terminals. J Neurosci. 26 (8), 2313-2320 (2006).
- Royle, S. J., Granseth, B., Odermatt, B., Derevier, A., Lagnado, L. Imaging phluorin-based probes at hippocampal synapses. Methods Mol Biol. 457, 293-303 (2008).
- Moulder, K. L., Mennerick, S. Reluctant vesicles contribute to the total readily releasable pool in glutamatergic hippocampal neurons. J Neurosci. 25 (15), 3842-3850 (2005).
- Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptopHluorin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 6131-6136 (2005).
- Morris, R. G. Elements of a neurobiological theory of hippocampal function: the role of synaptic plasticity, synaptic tagging and schemas. Eur J Neurosci. 23 (11), 2829-2846 (2006).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Calcium accelerates endocytosis of vSNAREs at hippocampal synapses. Nat Neurosci. 4 (2), 129-136 (2001).
- Balaji, J., Armbruster, M., Ryan, T. A. Calcium control of endocytic capacity at a CNS synapse. J Neurosci. 28 (26), 6742-6749 (2008).
- Ferguson, S. M., Brasnjo, G., et al. A selective activity-dependent requirement for dynamin 1 in synaptic vesicle endocytosis. Science. 316 (5824), 570-574 (2007).
- Baydyuk, M., Wu, X. S., He, L., Wu, L. G. Brain-derived neurotrophic factor inhibits calcium channel activation, exocytosis, and endocytosis at a central nerve terminal. J Neurosci. 35 (11), 4676-4682 (2015).
- Wu, X. S., Zhang, Z., Zhao, W. D., Wang, D., Luo, F., Wu, L. G. Calcineurin is universally involved in vesicle endocytosis at neuronal and nonneuronal secretory cells. Cell Rep. 7 (4), 982-988 (2014).
- Zhang, Z., Wang, D., et al. The SNARE proteins SNAP25 and synaptobrevin are involved in endocytosis at hippocampal synapses. J Neurosci. 33 (21), 9169-9175 (2013).
- Wu, L. -. G. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76 (1), 301-331 (2014).
- Daniele, F., Di Cairano, E. S., Moretti, S., Piccoli, G., Perego, C. TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in SH-SY5Y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis. J Vis Exp. (95), e52267 (2015).
- Shaner, N. C., Lin, M. Z., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (6), 545-551 (2008).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
- Leitz, J., Kavalali, E. T. Fast retrieval and autonomous regulation of single spontaneously recycling synaptic vesicles. Elife. 3, e03658 (2014).
- Bisht, K., El Hajj, H., Savage, J. C., Sánchez, M. G., Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;. Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with β-Amyloid Plaques. J Vis Exp. (112), e54060 (2016).
- Schikorski, T. Monitoring Synaptic Vesicle Protein Sorting with Enhanced Horseradish Peroxidase in the Electron Microscope. High-Resolution Imaging of Cellular Proteins: Methods and Protocols. , 327-341 (2016).
- Kononenko, N. L., Puchkov, D., et al. Clathrin/AP-2 mediate synaptic vesicle reformation from endosome-like vacuoles but are not essential for membrane retrieval at central synapses. Neuron. 82 (5), 981-988 (2014).
- Wu, Y., O’Toole, E. T., et al. A dynamin 1-, dynamin 3- and clathrin-independent pathway of synaptic vesicle recycling mediated by bulk endocytosis. eLife. 2014 (3), e01621 (2014).
- Heuser, J. E., Reese, T. S. Evidence for recycling of synaptic vesicle membrane during transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 57 (2), 315-344 (1973).
- Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Turnover of transmitter and synaptic vesicles at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 57 (2), 499-524 (1973).
- Watanabe, S., Rost, B. R., et al. Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses. Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).
- Watanabe, S., Trimbuch, T., et al. Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes. Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).
- Sankaranarayanan, S., Atluri, P. P., Ryan, T. A. Actin has a molecular scaffolding, not propulsive, role in presynaptic function. Nat Neurosci. 6 (2), 127-135 (2003).
- Zhu, Y., Xu, J., Heinemann, S. F. Two pathways of synaptic vesicle retrieval revealed by single-vesicle imaging. Neuron. 61 (3), 397-411 (2009).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Arnao, M. B. B., Acosta, M., del Rio, J. A. A., García-Cánovas, F. Inactivation of peroxidase by hydrogen peroxide and its protection by a reductant agent. Biochim Biophys Acta. 1038 (1), 85-89 (1990).
- Deák, F., Schoch, S., et al. Synaptobrevin is essential for fast synaptic-vesicle endocytosis. Nat Cell Biol. 6 (11), 1102-1108 (2004).
- Clayton, E. L., Evans, G. J. O., Cousin, M. A. Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation. J Neurosci. 28 (26), 6627-6632 (2008).
- Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).
- Wienisch, M., Klingauf, J. Vesicular proteins exocytosed and subsequently retrieved by compensatory endocytosis are nonidentical. Nat Neurosci. 9 (8), 1019-1027 (2006).
- Fernández-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling. Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).
- Gimber, N., Tadeus, G., Maritzen, T., Schmoranzer, J., Haucke, V. Diffusional spread and confinement of newly exocytosed synaptic vesicle proteins. Nat Commun. 6, 8392 (2015).
- Nicholson-Fish, J. C., Smillie, K. J., Cousin, M. A. Monitoring activity-dependent bulk endocytosis with the genetically-encoded reporter VAMP4-pHluorin. J Neurosci Methods. 266, 1-10 (2016).
- Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2006).
- Wisse, E., Braet, F., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World journal of gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing Photodamage in Live-Cell Microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Søndergaard, C. R., Garrett, A. E., et al. Structural artifacts in protein-ligand X-ray structures: implications for the development of docking scoring functions. J Med Chem. 52 (18), 5673-5684 (2009).
