בידוד של האוכלוסייה בצד Myc- המושרה T- תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה דג הזברה
Summary
כאן, אנו מתארים טכניקה לבודד את האוכלוסייה תאים בצד מ מודל דג הזברה של myc- המושרה T- תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה (T-ALL). זה assay האוכלוסייה בצד רגיש מאוד מתואר דג הזברה T-ALL, אבל זה עשוי להיות ישים סוגים אחרים של תאים ממאירים ולא ממאיר דג הזברה.
Abstract
אוכלוסיות תאים הטרוגניות, ברקמות בריאים או ממאירים, עשויות להכיל אוכלוסיה של תאים המאופיינים ביכולת דיפרנציאלית להפרדת צבע ה- DNA מחייב 33342. זה "אוכלוסיית הצד" של תאים ניתן לזהות באמצעות שיטות זרימה cytometric לאחר Hoechst 33342 צבע נרגש על ידי לייזר אולטרה סגול (UV). אוכלוסיית הצד של סוגי תאים רבים מכילה תאים דמויי גזע או אב. עם זאת, לא כל סוגי התאים יש אוכלוסייה בצד לזיהוי. Danio rerio , דג הזברה, יש חזקים במודל vivo של תא T-ALL לוקמיה חריפה (T-ALL), אבל אם אלה דג הזברה T-ALLs יש אוכלוסייה צד לא ידוע. השיטה המתוארת כאן מתאר כיצד לבודד את התאים האוכלוסייה בצד דג הזברה T-ALL. כדי להתחיל, T-ALL דג הזברה נוצרת באמצעות microinjection של פלסמידים tol2 לתוך עוברים שלב אחד תא. לאחר הגידול גדלו לשלב שבו הם מתפשטים לתוך יותר ממחצית האניהגוף של mal, תאי T-ALL ניתן לקצור. התאים אז מגואלות Hoechst 33,342 ובחנו ידי cytometry זרימה עבור תאי אוכלוסייה בצד. לשיטה זו יישומים רחב של דג הזברה T-ALL המחקר. אמנם אין סמנים פני תא ידוע של דג זברה כי לאשר תאי אוכלוסייה בצד אלה הם תאים דמויים גזע סרטני, in vivo מבחני השתלה פונקציונליים אפשריים. יתר על כן, transcriptomics מתא בודד יכול להיות מיושם כדי לזהות את המאפיינים הגנטיים של תאי האוכלוסייה בצד אלה.
Introduction
את assay האוכלוסייה בצד מנצל את היכולת המשופרת של תאים מסוימים בתוך רקמה כדי בזרימת צבע מחייב DNA Hoechst 33,342 בשל רמות גבוהות של קלטת מחייב ATP (ABC) חלבונים טרנספורטר על קרום התא. התאים בזרימת הצבע Hoechst 33,342 ניתן לזהות באמצעות ניתוח תזרים cytometric גל כפול אחרי צבען הוא נרגש על ידי לייזר UV. Assay זה שימש הראשון לזהות תאי גזע hematopoietic בעכברים (HSCs) 1, אבל זה ומאז משמש לזיהוי אוכלוסיות תאי גזע / ובתאים רבים רקמות סרטן (הנסקרת תוך התייחסות 2). עם זאת, לא כל האוכלוסיות של תאים יש אוכלוסייה בצד, ולא כל אוכלוסיות הצד מועשרות עבור תאי גזע / אב.
דג הזברה היא מערכת מודל גנטי חוליות עצמה לחקר סרטן 3 אנושי, 4, עם מספר היתרונות על פני mo בעכברים המסורתיdels של סרטן. עוברי דג זברה הם מופרים חיצוניים, ברורים אופטיים, הקלת transgenesis ואת תצפית in vivo של תהליכים פתולוגיים, לרבות ייזום התקדמות סרטן. נכון להיום, assay האוכלוסייה בצד לזהות תאי גזע או ובתאים פוטנציאל יושם רק עד לשד הכליה דג הזברה לזהות HSCs, ולא לכל דגמי סרטן דג הזברה 5, 6.
המודל דג הזברה של לוקמיה לימפובלסטית חריפה תאי T (T-ALL) היא מורפולוגית גנטית דומה האנושי T-ALL 7, 8, 11. T-ALL הוא ממאירות אגרסיבית כי, בבני אדם, מהווה 10-15% של ילדים ו 25% מכלל הבוגרים במקרים 9. בעוד הטיפול של T-ALL השתפר, הישנות עדיין נפוצה קשורה פרוגנוזה גרועה. T-ALL גידולים הם heterogeneיחידות ארגוניות ומכילות תת-אוכלוסיות תאים סרטניים רבות שונות, כוללים תאי ייזום לוקמיה (LICs). LICs מוגדר על ידי יכולתי להצמיח מחדש את הגידול כולו מתא בודד, ואת התדירות של LICs בתוך אוכלוסיית תאים סרטניים יכול להיות מחושב על ידי השתלת תאים במינונים משתנים לתוך נמענים באמצעות assay השתלת דילול מגביל (LDA). בעוד ניסויי LDA בוצעו דג זברה כדי לחשב את התדירות של 8 LICs, 10, 11, קביעה זו נעשית בדיעבד ואינה מאפשרת את הבידוד הפוטנציאלי של LICs. לכן, שיטה לבודדת פרוספקטיבית אוכלוסייה המועשרת עבור פעילות תאי גזע סרטני חסרה. זיהוי ובידוד תאי האוכלוסייה בצד מן דג הזברה טי יכלתי היא הצעד הראשון לקראת פונה חסר זה.
הפרוטוקול המובא כאן מתאר כיצד ליצור ביעילות T-ALL גידולים zebrafish ניצול transgenesis בתיווך-tol2, לקצור את T-ALL תאים גידולים, ואת להכתים אותם עם Hoechst 33,342 כדי לזהות את האוכלוסייה בצד של תאים. עתיד בניסויי vivo עם דג הזברה T-ALL יכול לכלול בין תאי האוכלוסייה בצד מועשרים עבור LICs או בעלי תכונות stem- או ובתאים אחרות דמויים.
Protocol
Representative Results
Discussion
Assay האוכלוסייה בצד הוא רגיש מאוד; לכן, שינויים קטנים בפרוטוקול יכול לגרום לקושי באיתור תאים באוכלוסייה בצד. ראשית, הטמפרטורה במהלך שלב מכתים הוא ספציפי לכל חיה / מערכת התא. עבור מערכות יונקים, assay האוכלוסייה בצד מבוצע בדרך כלל על 37 מעלות צלזיוס. כאשר דג הזברה T-ALL תאים הו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת דירקטוריון שיקגו נשים, קרן Case וונדי וויל, ואוניברסיטת גרנט מרכז התמיכה הסרטן שיקגו מקיף (CA014599 P30). ברצוננו להודות Core cytometry זרימה באוניברסיטת שיקגו עזרתם בהקמת הניסוי הזה, גם שאר חברי המעבדה דה יונג, במיוחד לסלי Pedraza ושון מקונל.
Materials
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific – AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific – NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific – SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) – 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 – 300 unit vials |
| 40 um mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL – Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
References
- Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).
- Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties. Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299, 887-890 (2003).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. , e2790 (2011).
- Martelli, A. M., et al. Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells. Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).
- Smith, A. C. H., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation. Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).
- . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. JoVE Science Education Database. , (2016).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. 암 연구학. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (1993).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct “side population” of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Komuro, H., et al. Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines. J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).
- Moshaver, B., et al. Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia. Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).
