Summary

IL-8トランジェントトランスジェニックマウスモデル<em>インビボ</em>炎症反応の長期モニタリング

Published: July 07, 2017
doi:

Summary

本明細書に記載の方法は、非侵襲性生物発光イメージング(BLI)を介したマウスの肺におけるIL-8プロモーター依存性炎症活性化の視覚化を可能にする。同じ動物を、ルシフェラーゼレポーター構築物の送達の時点から2ヶ月まで、複数回BLIに供することができる。

Abstract

気道炎症はしばしば細菌感染に関連し、肺疾患の主要な決定要因である。 インビトロでの種々の因子の炎症誘発能力の決定は困難であり、気管支肺胞洗浄およびその場での分析のための肺の除去などの終末処置を必要とし、同じマウスにおける縦視覚化を排除する。ここで、肺炎症は、異種IL-8ウシプロモーターの制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する一過性にトランスジェニックされたマウスにおける緑膿菌培養上清(SN)の気管内注入により誘導される。肺におけるルシフェラーゼ発現は、点滴後の2.5~48時間の時間フレームにわたるインビボ生物発光画像(BLI)分析によってモニターされる。この手順は2〜3ヶ月以内に複数回繰り返すことができ、同じマウスの炎症反応の評価を可能にする動物を終わらせる必要があります。このアプローチは、リアルタイムで肺に作用する前炎症性因子および抗炎症因子のモニタリングを可能にし、機能的および薬理学的研究に適していると思われる。

Introduction

喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、嚢胞性線維症(CF)および気管支拡張症などの慢性肺疾患は、気道炎症によって特徴付けられる。気道炎症は、浮腫、細胞浸潤、Tリンパ球および肥満細胞活性化、気道分泌の増加、および過剰なコラーゲン沈着を特徴とする。 CFは多系統障害であり、その死亡率および罹患率の主な原因は肺悪化の増大に伴う肺細菌感染である。肺機能の低下は、有意に不良な転帰1,2,3,4を予測する。

気道の炎症状態は、通常、喀痰のような下気道および上気道から誘導された物質における炎症過程中に動員された免疫学的マーカーの評価によって観察され、可変のresウルトラ。気管支鏡検査も行われる5 。マウスモデルは、気道炎症を特徴とする疾患の病因および進化を調査するための有効な治療または治癒がまだ同定されていない貴重なツールである。ヒトの状態( 例えば、タバコの煙の曝露、LPS、エラスターゼ、オボアルブミン、ポリI:C など )をシミュレートする化学物質の役割を含む、喘息および宿主 – 病原体の相互作用を研究するために、肺感染および炎症の動物モデルが使用されている上記の組み合わせと同様に) 6 。細菌負荷、肺のサイトカイン、および気管支肺胞洗浄液(BAL)を収集するために侵襲的アプローチが必要とされるため、炎症関連パラメータの測定には動物の犠牲が必要です。また、組織学的検査がしばしば必要とされる。炎症反応動態に関する情報を得る可能性は、numうっ血性のマウス。したがって、動物を犠牲にする必要なしにそのような情報を得ることを可能にする技術は、技術的、倫理的、経済的、および運用上の基礎上価値がある。

IL-8は、炎症過程に必須のプレーヤーであり、白血球を炎症組織に補充する。これは、炎症経路活性化の研究のための分子読み出しを表す。 MIP-2およびKCは、マウスにおけるヒトIL-8の機能相同体であり得る。マウスは、潜在的なIL-8受容体(ヒトCXCR2の相同体7,8)のみを発現するが、レポーター遺伝子を駆動する異種IL-8遺伝子プロモーターを調節することができる。ウシIL-8プロモーター/ルシフェラーゼレポーター構築物がマウスにおいてトランス活性化され得るという観察の後に、最近、肺炎症マウスモデルが開発された。この特徴は、生物発光イメージング(BLI)を利用して、ニールズ9

このモデルは、細菌エキソプロダクト( 例えば、細菌株によって放出されるLPSまたは産物)またはTNFα10,11によって引き起こされる炎症を研究するために適応されている。創薬プロセスは、CF、喘息、COPDなどの肺疾患を治療することができる新旧の抗炎症分子の開発と最適化に焦点を当てています。これらの新しい化学物質は、スマートな臨床試験の設計を容易にするために、特定の臨床表現型に関連付けることができる動物モデルで迅速かつ簡便に試験されなければならない。

Protocol

記載されたすべての動物実験は、ベローナ大学の実験研究サービス部門間動物実験のための動物実験のための教室内の動物福祉委員会によって承認され、欧州指令2010/63 UE、Italian D.Lgs 26/2014および改訂版「実験動物のケアおよび使用のためのガイド」ワシントンDC:National Academy Press、1996.このプロトコールおよび実験は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)(n 273/15)によって承認された…

Representative Results

BIL-8-Luc一過性トランスジェニックマウスモデルを、分泌されたビルレンス因子を含む濃縮細菌上清(30x)でチャレンジしたマウスの肺炎症のin vivoモニタリングに使用した。誘導された炎症応答は、BLIシグナルの増加としてインビボイメージングによって検出可能であった。前炎症活性は、点眼後2.5時間ではっきりと検出可能であったが、BLIシグナルは5?…

Discussion

以前の研究11では、bIL-8-Luc依存性BLIマーカーとBALマーカーとの間のコントラストが示された。それはマウス系統12内の感度の差異に依存していた12 。この理由から、異なるマウス株へのbIL-8-Lucモデルの最初の適用は、BLIおよびより標準化された炎症マーカーの両方の炎症反応の初期研究を必要とする。

マウスのトラン?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、イタリア嚢胞性線維症プロジェクトFFC#18/2013、FFC#29/2015、イタリア嚢胞性線維症連盟(Veneto Branch-Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus)の支援を受けました。

Materials

FMT 2500 Fluorescence Tomography System Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo Imaging System Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
MMPsense 750 FAST Perkin Elmer Inc. NEV10001EX Protect from light, store the probe at 4 °C
Female inbred BalbC Harlan Laboratories Italy Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
bIL-8-Luc plasmid Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy Store the plasmid at -20 °C
pGL3basic vector Promega E1751 Store the vector at -20 °C
JetPEI DNA transfection reagent Polyplus transfection 201B-001G The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7
D-luciferin potassium salt 1g Perkin Elmer Inc. 122796 Protect from light, store at -20 °C
Living Image software Caliper Life Sciences, Experimental Builder
Isoflurane ESTEVE spa 571329.8 Do not inhale
Bio-Plex Cytokine Assay Kit Bio-Rad Laboratories M60-009RDPD Store the unopened kit at 4 °C
Automated cell counter Dasit XT 1800J Experimental Builder
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator Penn-century DPM-EXT
Gas anesthesia system XGI-8 Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
PE190 micro medical tubing 2biological instruments snc BB31695-PE/8
Syringe without needle 5ml Terumo SS*05SE1 Cut the boards of the piston by a scissors
Hamilton 0,10 ml (model 1710) Gastight 81022
Discofix 3-way Stopcock Braun 4095111
Syringe with needle 1ml Pic solution 3,071,260,300,320 Use without needle
Plastic feeding tubes 18ga x 50mm 2biological instruments snc FTP-18-50 Cut obliquely the tip 

References

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Cite This Article
Bergamini, G., Stellari, F., Sandri, A., M. Lleo, M., Donofrio, G., Ruscitti, F., Boschi, F., Sbarbati, A., Villetti, G., Melotti, P., Sorio, C. An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses. J. Vis. Exp. (125), e55499, doi:10.3791/55499 (2017).

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