Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.
Extravasatie van lymfocyten in het centrale zenuwstelsel (CZS) is essentieel voor immuun surveillance. Ziekte-gerelateerde veranderingen van lymfocyten extravasatie kan resulteren in pathofysiologische veranderingen in het centrale zenuwstelsel. Aldus onderzoek lymfocytenmigratie in het CZS is belangrijk inflammatoire CNS-ziekten te begrijpen en nieuwe therapie benaderingen te ontwikkelen. Hier presenteren we een in vitro model van het menselijk bloed-hersenbarrière lymfocyten extravasatie bestuderen. Menselijk brein microvasculaire endotheelcellen (HBMEC) worden confluent gekweekt op een poreuze polyethyleentereftalaat Transwell voegen aan het endotheel van de bloed-hersenbarrière nabootsen. Barrièrefunctie wordt gevalideerd door zonula occludens immunohistochemie transendothele elektrische weerstand (TEER) metingen en analyse van Evans blauw permeatie. Dit model maakt het mogelijk onderzoek naar de diapedesis van zeldzame lymfocyten zoals CD56 heldere CD16 dim / – NK-cellen. Furthermerts, de werking van andere cellen, cytokines en chemokines, ziektegerelateerde veranderingen en verschillende behandelingsregimes op het trekkende capaciteit van lymfocyten kunnen worden bestudeerd. Tenslotte kan het effect van inflammatoire stimuli evenals verschillende behandelingsregimes op de endotheliale barrière te analyseren.
Lymfocytenmigratie uit het bloed naar de weefsels is cruciaal voor immuun surveillance. Een reeks van specifieke moleculaire interacties zorgt plaatsspecifieke extravasatie in kleine darm, huid, lymfeknopen, het centrale zenuwstelsel (CZS) en andere weefsels 1. Veranderingen in lymfocytenmigratie betrokken zijn bij de pathofysiologie van een aantal wijdverbreide ziekten 2. Migratie in de immuun-geprivilegieerde CNS wordt strak gereguleerd en dus veranderingen van deze werkwijze zijn betrokken bij CZS-gerelateerde ziekten zoals encefalomyelitis 3, neuromyelitis optica, beroerte en multiple sclerosis (MS) 2, 4, 5, 6, 7. Daarom is het belangrijk om lymfocyten extravasatie bestuderen om beter te begrijpen ziekte pathofysiologie en hulpmiddelen voor een te ontwikkelen melioration ziektelast 8, 9, 10, 11, 12.
Lymfocyten migreren in het CNS via verschillende routes. Extravasatie tot postcapillaire venules in de subarachnoïdale ruimte via de bloed-cerebrospinale vloeistofbarrière in de choroid plexus en over de bloed-hersenbarrière zijn beschreven 1, 13, 14, 15. Migratie over de bloed-hersenbarrière wordt uitgevoerd door de interactie van lymfocyten aan endotheelcellen 14. In tegenstelling tot endotheliale cellen in de periferie, endotheliale cellen van het CNS tot expressie grote hoeveelheden tight junction moleculen, waardoor strikte beperking van het aantal cellen en eiwitten die in staat de bloed-hersenbarrièrelass = "xref"> 16. Ontsteking leidt tot loskomen van nauwe overgangen en induceert de expressie van adhesiemoleculen; dus verbeteren lymfocytenmigratie in het CZS 1, 17, 18.
Extravasatie via de bloed-hersenbarrière is een meerstaps werkwijze. Lymfocyten tether de endotheelcellen en rol langs het endotheel in een proces in hoofdzaak gemedieerd door selectinen 1, 15. Vervolgens interacties tussen chemokinen uitgescheiden door het endothelium en de respectieve chemokinereceptoren tot expressie gebracht op lymfocyten conformatieveranderingen van integrinen, waardoor stevige adhesie aan endotheelcellen bevorderen 1. Tenslotte lymfocyten ofwel kruipen langs de endotheliale barrière tegen de bloedstroom voordat transmigrerende in de perivasculaire ruimte of onmiddellijk en rechtstreeks verzendende kraamigrate op de plaats van stevige adhesie 1, 19, 20. Al deze stappen lymfocyt extravasatie kan worden geanalyseerd in vitro gebruik van verschillende technieken 21. Time-lapse video microscopie wordt gebruikt om de initiële tethering en rollen 15 te bestuderen. Hechting testen leveren gedetailleerde informatie over firma arrestatie belemmeringen 22 endotheel. Transmigratie assays zoals hier getoond laten analyse van immuuncel transmigratie 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.
Met het menselijke in vitro bloed-hersenbarrière model konden we onlangs laten zien dat een hogere migrAtory aantal CD56 heldere CD16 dim / – NK-cellen in vergelijking met hun CD56 dim CD16 + tegenhangers werd gereflecteerd door een overwicht van deze NK-cel subsets in de intrathecale ruimte 21. Zo, onze experimentele opstelling lijkt geschikt zijn om de in vivo situatie na te bootsen zijn.
Hier presenteren we een techniek om de transmigratie van lymfocyten over het menselijk bloed-hersenbarrière te onderzoeken. In vitro analyse van lymfocyt migratie naar het CZS is belangrijk basisprocessen van lymfocyten extravasatie mogelijke ziektegerelateerde veranderingen en nieuwe therapeutische benaderingen bestuderen.
Verschillende modificaties van de bloed-hersenbarrière model mogelijk. Bijvoorbeeld kunnen cellen van het bovenste compartiment worden geanalyseerd om de samen…
The authors have nothing to disclose.
This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 “Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease” (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).
PBS | Gibco | 14190-094 | without CaCl2 or MgCl2 |
Fibronectin 1mg/mL | Sigma | F1141-5MG | from bovine plasma |
T-25 cell culture flask | Greiner BioOne | 690160 | |
HBMEC | ScienCell | 1000 | |
Pelobiotech | PB-H-6023 | ||
Accutase | Sigma | A6964-100ML | |
ECM-b | ScienCell | 1001-b | |
FBS | ScienCell | 1001-b | |
Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 1001-b | |
Endothelial cell growth supplement | ScienCell | 1001-b | |
Transwell | Corning | 3472 | clear, 6.5mm diameter, 3.0µm pore size |
96-well flat bottom plate | Corning | 3596 | |
Evans blue | Sigma | E2129-10G | stock solution: 1 g/50 mL PBS |
B27 | Gibco | 17504-044 | 50x concentrated |
Infinite M200Pro | Tecan | ||
96-well black flat bottom plate | Greiner BioOne | 675086 | |
48-well plate | Corning | 3526 | |
RPMI 1640 | Gibco | 61870-010 | |
Flow Count Fluorospheres | Beckman Coulter | 7547053 | |
Na-EDTA | Sigma | E5134 | |
BSA | Sigma | A2153 | |
Gallios 10-color flow cytometer | Beckman Coulter | ||
Kaluza 1.5a | Beckman Coulter | ||
TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
IFN-γ | Peprotech | 300-02 | |
CD3-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 300430 | clone UCHT1 |
CD56-PC7 | Beckman Coulter | A21692 | clone N901 |
CD16-A750 | Beckman Coulter | A66330 | clone 3G8 |
CD4-FITC | Biolegend | 300506 | clone RPA-T4 |
CD8-A700 | Beckman Coulter | A66332 | clone B9.11 |