Kvalitativ og kvantitativ analyse av immun Synapse i menneskelige systemet ved hjelp av Imaging flowcytometri
Summary
Her beskriver vi en komplett arbeidsflyt for kvalitativ og kvantitativ analyse av immun synapser mellom primær menneskelige T-celler og antigen presentere celler. Metoden er basert på tenkelig flowcytometri, hvilke innrømmer oppkjøp og evaluering av flere tusen celle bilder i en relativt kort tidsperiode.
Abstract
Immun synapse er det kommunikasjon mellom T celler og antigen presentere celler (APCs). T celler polarize overflate reseptorer og proteiner mot immun synapse å sikre en stabil binding og signal exchange. Klassisk AC confocal, TIRF eller super-oppløsning mikroskopi har blitt brukt til å studere immun synapse. Siden disse metodene krever manuell bildeopptak og tidkrevende måling, er avbilding av sjeldne hendelser utfordrende. Her beskriver vi en arbeidsflyt som gjør morfologisk analyse av titusenvis av celler. Immun synapser er indusert mellom primær menneskelige T-celler i pan-leukocytter forberedelser og Staphylococcus aureus enterotoksin B SEB lastet Raji celler som APCs. Bildeopptak utføres med imaging flowcytometri, også kalt i flyt mikroskopi, som kombinerer funksjonene til en flyt cytometer og fluorescens mikroskop. En komplett gating strategi for å identifisere T celle/APC par og analysere de immun synapser tilbys. Som denne arbeidsflyten analyse av immun synapser i urenset pan-leukocytter forberedelser og dermed krever bare en liten mengde blod (dvs., 1 mL), den kan brukes på prøver fra pasienter. Viktigere, kan flere prøver bli forberedt, målt og analysert parallelt.
Introduction
T-celler er store regulatorer av adaptive immunsystemet og aktiveres gjennom antigen peptider som presenteres i sammenheng med store histocompatibility komplekser (MHC). Full T-celle aktivering krever to signaler, kompetanse signalet via antigen-spesifikke T-celle reseptor (TCR) / CD3 komplekse og costimulatory signalet via tilbehør reseptorer. Begge signalene blir generert gjennom direkte samspill av T-celler med antigen-presentere celler (APCs). Eldre APCs gi kompetanse signalet for T-celle aktivering gjennom MHC-peptid komplekser, og de uttrykker costimulatory ligander (f.eks, CD80 eller CD86) å sikre progresjon av T-celle aktivering1. En viktig funksjon av costimulation er omorganisering av utgangen cytoskjelett2,3,4. Den kortikale F-utgangen er forholdsvis statiske i hviler T celler. T-celle stimulering gjennom antigen-bærende APCs fører til en dyp omorganisering av utgangen cytoskeleton. Utgangen dynamics (dvs., rask begrepsordbok polymerisasjon/depolymerization sirkler) aktiverer T-celler å lage styrker som brukes til å transportere proteiner eller organeller, for eksempel. Videre er begrepsordbok cytoskeleton viktig for å utvikle en spesiell kontakt sonen mellom T celler og APCs, kalt immun synapse. På grunn av betydningen av utgangen cytoskeleton til immun synapse, har det blitt nødvendig å utvikle metoder for å kvantifisere endringer i utgangen cytoskeleton T celler5,6,7,8 , 9.
Ved utgangen cellen cytoskjelett bistand, er overflate reseptorer og signalnettverk proteiner segregerte i supramolecular aktivisering klynger (SMACs) i immun synapse. Stabiliteten av immun synapse sikres ved binding av reseptorer til F-utgangen bunter som øker elastisitet i utgangen cytoskeleton. Immun synapse dannelsen har vist seg å være kritisk for generering av adaptive immunreaksjoner. De skadelige virkningene av en defekt immun synapse formasjon i vivo var skjønte hos pasienter som lider fra Wiskott Aldrich syndrom (WAS), en sykdom som begrepsordbok polymerisasjon og samtidig, immun synapse formasjon er forstyrret10 . VAR pasienter kan lide av eksem, alvorlig tilbakevendende infeksjoner, autoimmune sykdommer og melanomer. Til tross for dette funnet, er det for øyeblikket ikke kjent om immun synapse formasjon er forskjellig i de T-cellene friske individer og pasienter som lider av immun defekter eller autoimmune sykdommer.
Fluorescens mikroskopi, inkludert AC confocal, TIRF og super-oppløsning mikroskopi, ble brukt til å avdekke arkitektur immun synapse11,12,13,14. Den høye oppløsningen av disse systemene og mulighet til å utføre live-celle imaging muliggjør innsamling av nøyaktig spatio-temporale informasjon om utgangen cytoskeleton og overflaten eller intracellulær proteiner i immun synapse. Mange resultater, men er basert på analyse av bare noen titalls T celler. Videre må T celler være renset for disse typer fluorescens mikroskopi. Men for mange forskning spørsmål er bruk av urenset celler i stedet for den høyest mulige oppløsningen av største betydning. Dette er relevant hvis T celler fra pasienter blir analysert, siden mengden donert blod er begrenset og det kan være behovet for mange prøver parallelt.
Vi etablert mikroskopiske metoder som tillater analyse av utgangen cytoskeleton i immun synapse i mennesket15,16,17. Disse metodene er basert på imaging flowcytometri, også kalt i flyt mikroskopi18. Som en hybrid mellom multispectral flyt cytometri og fluorescens mikroskopi, imaging flowcytometri har sin styrke i å analysere morfologiske parametere og protein lokalisering i ulike celle populasjoner, for eksempel pan-leukocytter fra den perifert blod. Vi introduserte en metode som gjør det muliggjør for oss å kvantifisere F-utgangen i T-celle/APC conjugates av menneskelige T-celler fra hele-blodprøver, uten behov for tidkrevende og kostbare rensing trinnene17. Teknikken presenteres her omfatter hele arbeidsflyten blir blodprøve for kvantifisering av F-utgangen i immun synapse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Arbeidsflyten presenteres her gjør det mulig for kvantifisering av immun synapser mellom menneskelige T-celler (ex vivo) og pansrede. Spesielt ble røde blodlegemer-lysed pan-leukocytter brukt som T-celle kilder, gjør T-celle rensing trinnene unnværlig. B-celle lymfom celle linjen Raji servert som surrogat APCs. Dette bærer betydelige fordeler, siden det gjør sammenligninger mellom blodgivere av T-celle siden av immun synapse. Videre er autologous DCs neppe tilgjengelig direkte fra eksterne menneskeblod. Produksjone…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet ble finansiert av tyske council (DFG) med tilskudd. SFB-938-M og SA 393/3-4.
Materials
| >Multifuge 3 SR | Heraeus | ||
| RPMI 1640 | LifeTechnologies | #11875085 | 500 mL |
| FCS | Pan Biotech#3302-P101102 | ||
| Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | #352054 | 5 mL |
| Kulturflasche | Thermo Scientific | #178883 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8662 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth | #8076.3 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | #16005 | |
| FACS Wash Saponin | PBS 1% BSA 0.15 Saponin | ||
| ReaktiosgefaB | Sarstedt | 72.699.002 | 0.5 mL |
| Speed Bead | Amnis | #400041 | |
| Minishaker MS1 | IKA Works | MS1 | |
| Mikrotiterplatte | Greiner Bio One | #650101 | 96U |
| Enterotoxin SEB | Sigma Aldrich | S4881 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 1:3000 |
| CD3-PeTxR | Invitrogen | MHCD0317 | 1:30 |
| Phalloidin-AF647 | Molecular Probes | A22287 | 1:150 |
| IS100 | Amnis | Imaging flow cytometer | |
| IDEAS | Amnis | Software | |
| INSPIRE | Amnis | Software |
References
- Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
- Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
- Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
- Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68 (2016).
- Piragyte, I., Jun, C. D. Actin engine in immunological synapse. Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).
- Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. Super-resolution microscopy of the immunological synapse. Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
- Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
- Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421 (2012).
- Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
- Basiji, D., O’Gorman, M. R. Imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).
- Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
- Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
- Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
