Cytometry 이미징 사용 하 여 인간의 시스템에 면역 시 냅 스의 질적 및 양적 분석
Summary
여기, 우리는 기본 인간 T 세포와 항 원 제시 세포 면역 시 냅 스의 정성 및 정량 분석을 위한 완벽 한 워크플로우를 설명합니다. 메서드 인수 및 시간의 상대적으로 짧은 기간 내에 몇 천 셀 이미지의 평가 허용 하는 이미징 cytometry를 기반으로 합니다.
Abstract
면역 시 냅 스는 T 세포와 항 원 제시 세포 (Apc) 간의 통신의 영역입니다. T 세포 표면 수용 체와 안정적인 바인딩을 확신 하 고 교류 신호를 면역 냅으로 단백질 분극. 클래식 confocal, TIRF, 또는 슈퍼 해상도 현미경 면역 시 냅 스 연구에 사용 되었습니다. 때문에 이러한 방법을 사용 하려면 수동 이미지 수집 및 시간이 걸리는 정량화, 드문 이벤트의 영상 도전 이다. 여기, 우리 세포의 수천 수만의 형태소 분석을 가능 하 게 워크플로 설명 합니다. 면역 시 냅 스는 Apc로 팬 백혈구 준비에 기본 인간 T 세포와 황색 포도상구균 enterotoxin B 셉 로드 들의 삶 문의 세포 사이 유도. 이미지 수집 이미징 cytometry 라고도 흐름에 현미경 검사 법, 교류 cytometer 및 형광 현미경의 기능을 결합 하 여 수행 됩니다. T 세포/APC 커플 식별 하 고 분석 하는 면역 시 냅 스에 대 한 완전 한 제어 전략은 제공 됩니다. 면역 분석 unpurified 팬-백혈구 준비에 synapses 하며 따라서 작은 양의 혈액이이 허용 (즉,, 1 mL), 환자에서 샘플에 적용할 수 있습니다. 중요 한 것은, 여러 샘플 준비, 측정, 고 병렬로 분석.
Introduction
T 세포는 적응 면역 시스템의 주요 규제 하 고 중요 한 조직 적합성 복합물 (MHC)의 맥락에서 제시 하는 항 원 펩 티 드를 통해 활성화 됩니다. 전체 T 세포 활성화 필요 2 개의 신호, 항 원 특정 T 세포 수용 체 (TCR)를 통해 능력 신호 / CD3 복합물 및 액세서리 수용 체를 통해 costimulatory 신호. 두 신호는 항 원 제시와 T 세포의 직접적인 상호 작용을 통해 생성 된 세포 (Apc). 성숙한 APCs MHC 펩 티 드 복합물을 통해 T 세포 활성화에 대 한 적성 신호를 제공 하 고 그들은 costimulatory ligands 표현 (예:, CD80 또는 CD86) T 세포 활성화1의 진행을 보장 하기 위해서. Costimulation의 1 개의 중요 한 기능 말라 골격2,,34의 재배치입니다. 대뇌 피 질의 F 걸 T 세포 휴식에서 상대적으로 정적입니다. 항 원-베어링 APCs 통해 T 세포 자극 말라 골격의 심오한 재배치에 지도 한다. 말라 역학 (즉,, 빠른 걸 합/depolymerization 원) T 세포를 만드는 단백질 이나 세포, 예를 들어 전송 하는 데 사용 되는 힘을 사용 합니다. 또한, 말라 골격은 T 세포 및 면역 시 냅 스 라고 하는 APCs 사이 특별 한 연락처 영역을 개발 하기 위한 중요 합니다. 면역 시 냅 스를 말라 골격의 중요성 때문에 그것은 T 세포5,6,,78 의 말라 골격에 변화를 측정 하는 방법을 개발 하기 위해 필수적인 되고있다 , 9.
말라 cytoskeletal 원조에 의하여 표면 수용 체와 신호 전달 단백질 supramolecular 활성화 클러스터 (SMACs) 면역 시 냅 스 내에서 차별 됩니다. 면역 시 냅 스의 안정성은 말라 골격의 신축성을 증가 하는 F-말라 번들에 수용 체의 바인딩을 의해 보장 됩니다. 면역 시 냅 스 형성은 적응형 면역 반응의 생성에 대 한 중요 한 것을 보였다. Vivo에서 결함이 있는 면역 시 냅 스 대형의 해로운 효과 했다 깨 달 았에서 Wiskott 올드 리치 증후군 (WAS), 어떤 걸 중 합에는 질병을 고통 받아 환자에서 면역 시 냅 스 형성을 방해 하는 수반, 그리고10 . 환자는 습 진, 심한 재발 성 감염, 자가 면역 질환, 그리고 정면을에서 고통을 수 있습니다 했다. 이 발견에도 불구 하 고 그것은 현재 알 수 없습니다 면역 결함 또는 자가 면역 질환으로 고통 받는 환자와 건강 한 개인의 T 세포에서 면역 시 냅 스 형성 다릅니다 여부.
형광 현미경 검사 법, confocal 포함, TIRF, 및 최고 해결책 현미경 검사 법, 면역 시 냅 스11,12,,1314의 아키텍처를 밝히기 위해 사용 되었다. 이러한 시스템의 높은 해상도 라이브 셀 이미징 수행 가능성 말라 골격과 면역 시 냅 스에 표면 또는 세포내 단백질에 대 한 정확한, spatio 시간적 정보 수집 수 있습니다. 그러나 많은 결과, 몇 수십 T 세포의 분석에 근거한 다. 또한, 이러한 유형의 형광 현미경 검사 법에 대 한 T 세포를 정화 해야 합니다. 그러나, 많은 연구 질문에 대 한 unpurified 셀 보다는 가능한 가장 높은 해상도의 사용은 매우 중요. 이것은 환자에서 T 세포는 분석 때문에 헌 혈 된 혈액의 양을 제한 하 고 동시에 많은 샘플을 처리할 필요가 있을 수 있습니다 하는 경우 이다.
우리 인간의 시스템15,,1617면역 시 냅 스에 걸 골격의 분석을 허용 하는 현미경 방법을 설립 했다. 이러한 메서드는 흐름에 현미경18라고도 cytometry 이미징 기반으로 합니다. Multispectral 흐름 cytometry 및 형광 현미경 사이의 하이브리드, cytometry 이미징 장점이 그것의 형태학 매개 변수 및 다른 유형의 세포 인구에서 팬 백혈구 등에서 단백질 지역화 분석에 주변 혈액입니다. 우리는 우리가 시간과 비용이 많이 드는 정화 단계17의 필요 없이 전체 혈액 샘플에서 인간 T 세포의 T-셀/APC 어원이 같은 말에 F-말라를 계량 수 있습니다 하는 방법 소개. 여기에 제시 된 기술은 면역 시 냅 스에 F 걸의 정량화를 혈액 샘플에서 전체 워크플로 구성 되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시 된 워크플로 (ex vivo) 인간 T 세포와 APCs 사이 면역 시 냅 스의 정량화를 수 있습니다. 특히, 팬-백혈구 적혈구 lysed 불가결 T 세포 정화 단계를 만드는 T-셀 원본으로 사용 되었다. B-세포 림프 종 세포 라인 들의 삶 문의 대리 APCs 역임 했습니다. 면역 시 냅 스의 T-세포의 혈액 기증자 사이 비교 수 있기 때문이 맺는 중요 한 이점이 다. 또한, 헌 Dc 거의 주변 인간의 혈액에서 직접 사용할 수 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
작품 번호 보조금 독일 연구 위원회 (DFG)에 의해 투자 되었다 SFB-938-M 고 SA 393/3-4.
Materials
| >Multifuge 3 SR | Heraeus | ||
| RPMI 1640 | LifeTechnologies | #11875085 | 500 mL |
| FCS | Pan Biotech#3302-P101102 | ||
| Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | #352054 | 5 mL |
| Kulturflasche | Thermo Scientific | #178883 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8662 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth | #8076.3 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | #16005 | |
| FACS Wash Saponin | PBS 1% BSA 0.15 Saponin | ||
| ReaktiosgefaB | Sarstedt | 72.699.002 | 0.5 mL |
| Speed Bead | Amnis | #400041 | |
| Minishaker MS1 | IKA Works | MS1 | |
| Mikrotiterplatte | Greiner Bio One | #650101 | 96U |
| Enterotoxin SEB | Sigma Aldrich | S4881 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 1:3000 |
| CD3-PeTxR | Invitrogen | MHCD0317 | 1:30 |
| Phalloidin-AF647 | Molecular Probes | A22287 | 1:150 |
| IS100 | Amnis | Imaging flow cytometer | |
| IDEAS | Amnis | Software | |
| INSPIRE | Amnis | Software |
References
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