Summary

Analisi qualitativa e quantitativa della sinapsi Immune nel sistema umano utilizzando Imaging citometria a flusso

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Qui, descriviamo un completo flusso di lavoro per l’analisi qualitativa e quantitativa del sistema immunitarie sinapsi tra cellule T umane primarie e cellule presentanti l’antigene. Il metodo si basa su imaging citometria a flusso, che permette l’acquisizione e la valutazione di diverse immagini di migliaia di cellule all’interno di un periodo di tempo relativamente breve.

Abstract

La sinapsi immune è l’area di comunicazione tra le cellule di T e cellule presentanti l’antigene (APCs). Cellule T polarizzano recettori e proteine verso la sinapsi immune per assicurare un’associazione stabile e cambio di segnale. Microscopia confocale, TIRF o super-risoluzione classica sono stati usati per studiare la sinapsi immune. Poiché questi metodi richiedono acquisizione immagine manuale e quantificazione richiede molto tempo, l’imaging di eventi rari è impegnativo. Qui, descriviamo un flusso di lavoro che consente l’analisi morfologica di decine di migliaia di celle. Sinapsi immuni sono indotte tra cellule T umane primarie nelle preparazioni di pan-leucociti e cellule di Raji B SEB-caricato di Staphylococcus aureus enterotossina come APC. Acquisizione delle immagini viene eseguita con imaging citometria a flusso, anche chiamato microscopia In-Flow, che combina le caratteristiche di un citometro a flusso e un microscopio a fluorescenza. Una completa strategia di gating per l’identificazione delle cellule T/APC coppie e analizzando le sinapsi immuni è fornita. Come questo flusso di lavoro consente l’analisi di immunitario sinapsi in preparazioni non purificata pan-del leucocita e quindi richiede solo un piccolo volume di sangue (cioè, 1 mL), può essere applicato a campioni da pazienti. D’importanza, diversi campioni possono essere preparati, misurati e analizzati in parallelo.

Introduction

Le cellule T sono importanti regolatori del sistema immunitario adattativo e vengono attivate attraverso peptidi antigenici che sono presentati nel contesto dei complessi di istocompatibilità (MHC). Attivazione a cellula T completo richiede due segnali, il segnale di competenza attraverso il recettore di antigene-specifiche cellule T (TCR) / CD3 complesso e il segnale di costimolazione tramite ricevitori accessori. Entrambi i segnali sono generati attraverso l’interazione diretta delle cellule di T con presentanti l’antigene (APCs) di cellule. APCs maturo forniscono il segnale di competenza per l’attivazione di cellule T attraverso complessi MHC-peptide, ed esprimono ligandi costimolazione (ad es., CD80 o CD86) per assicurare la progressione della cellula T di attivazione1. Una importante funzione di costimolazione è il riarrangiamento del citoscheletro actina2,3,4. La F-actina corticale è relativamente statico in cellule di T di riposo. Stimolazione delle cellule T attraverso antigene-cuscinetto APCs conduce ad una profonda riorganizzazione del citoscheletro. Dinamica dell’actina (cioè, veloce actina polimerizzazione/depolimerizzazione cerchi) attiva le cellule di T di creare forze che vengono utilizzate per il trasporto di proteine o organelli, ad esempio. Inoltre, il citoscheletro di actina è importante per lo sviluppo di una speciale zona di contatto tra le cellule di T e APC, chiamato sinapsi immune. Data l’importanza del citoscheletro alla sinapsi immune, è diventato essenziale per sviluppare metodi per quantificare i cambiamenti nel citoscheletro delle cellule T5,6,7,8 , 9.

Per mezzo di aiuti del citoscheletro di actina, recettori e proteine di segnalazione sono segregati nei cluster di attivazione supramolecolari (SMACs) all’interno della sinapsi immune. La stabilità della sinapsi immune è assicurata dall’associazione dei recettori ai pacchi di F-actina che aumentano l’elasticità del citoscheletro. Formazione della sinapsi immuni è stato indicato per essere critico per la generazione della risposta immune adattativa. Gli effetti nocivi di una formazione di sinapsi immunitaria difettosa in vivo in primo luogo sono stati realizzati in pazienti affetti da Wiskott Aldrich sindrome (WAS), una malattia in cui polimerizzazione dell’actina e, simultaneamente, la formazione della sinapsi immuni sono disturbati10 . ERA i pazienti possono soffrire di eczema, gravi infezioni ricorrenti, malattie autoimmuni e melanomi. Nonostante questa individuazione, attualmente non è noto se la formazione della sinapsi immuni è diverso nelle cellule T di individui sani e pazienti affetti da malattie autoimmuni o difetti immuni.

Microscopia a fluorescenza, compresi confocale, TIRF e microscopia di Super-risoluzione, sono stati utilizzati per scoprire l’architettura del sistema immunitario sinapsi11,12,13,14. L’alta risoluzione di questi sistemi e la possibilità di effettuare formazione immagine della vivere-cella consente la raccolta di informazioni esatte, spazio-temporali su citoscheletro e proteine di superficie o intracellulare nella sinapsi immune. Molti risultati, tuttavia, sono basati sull’analisi di solo poche decine di cellule T. Inoltre, le cellule T devono essere depurate per questi tipi di microscopia a fluorescenza. Tuttavia, per molte domande di ricerca, l’uso di cellule impura, piuttosto che la risoluzione massima possibile è della massima importanza. Ciò è rilevante se le cellule di T dai pazienti vengono analizzate, dato che l’importo delle donazioni di sangue è limitato e potrebbe esserci la necessità di elaborare molti campioni in parallelo.

Abbiamo stabilito metodi microscopici che consentono l’analisi del citoscheletro nella sinapsi immune nel sistema umano15,16,17. Questi metodi sono basati su citometria a flusso, anche denominato In-Flow microscopia18di imaging. Come un ibrido tra microscopia di fluorescenza e citometria a flusso multispettrale, citometria a flusso di imaging ha suoi punti di forza nell’analizzare parametri morfologici e la localizzazione della proteina in popolazioni eterogenee delle cellule, quali pan-leucociti dalla nel sangue periferico. Abbiamo introdotto una metodologia che permette di quantificare F-actina in coniugati di T-cellula/APC di cellule T umane da campioni di sangue intero, senza la necessità di lunghe e costose purificazione passaggi17. La tecnica qui presentata comprende l’intero flusso di lavoro, di ottenere il campione di sangue per la quantificazione di F-actina nella sinapsi immune.

Protocol

1. preparazione del Pan-leucociti Disegnare 1 mL di sangue periferico da un donatore sano (o paziente) in una siringa eparinizzata. Assicurarsi di avere l’approvazione del comitato etico competente per la donazione di sangue. Mescolare 1 mL di periferico umano sangue con 30 mL di tampone di lisi ACK (150mm NH4Cl, 1 mM KHCO3e 0,1 mM EDTA, pH 7,0) in una provetta da 50 mL e incubare per 8 min a temperatura ambiente. Riempire le provette con PBS e centrifugare a 300 x …

Representative Results

Degli obiettivi principali del metodo descritto qui è la quantificazione dell’arricchimento di proteine (ad es., -F-actina) nella sinapsi immunitaria tra APC (cellule di Raji) e cellule di T in impura pan-leucociti prelevati campioni di sangue umano di basso volume (1 mL) di surrogati. Nella schermata nella Figura 1 fornisce una panoramica della strategia di gating critica di questo metodo. Mostra la Galleria immagini a sinistra e l’area di analisi sulla destra …

Discussion

Il flusso di lavoro qui presentato consente la quantificazione di immuni sinapsi tra cellule T umane (ex vivo) e APC. In particolare, dell’eritrocito-lisate pan-leucociti sono stati utilizzati come fonti di cellule T, rendendo superfluo fasi di purificazione della T-cellula. La linea cellulare di linfoma della B-cellula Raji servita come surrogato APCs. Questo comporta notevoli vantaggi, poiché permette confronti tra i donatori di sangue del lato della T-cellula della sinapsi immune. Inoltre, DCs autologo sono difficilm…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il lavoro è stato finanziato dal Consiglio di ricerca tedesco (DFG) con sovvenzioni No. SFB-938-M e SA 393/3-4.

Materials

>Multifuge 3 SR Heraeus
RPMI 1640 LifeTechnologies #11875085 500 mL
FCS Pan Biotech#3302-P101102
Polystyrene Round Bottom Tube Falcon #352054 5 mL
Kulturflasche Thermo Scientific #178883
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma D8662
Bovine Serum Albumin Roth #8076.3
Saponin Sigma S7900
Paraformaldehyde Sigma Aldrich #16005
FACS Wash Saponin PBS 1% BSA 0.15 Saponin
ReaktiosgefaB Sarstedt 72.699.002 0.5 mL
Speed Bead Amnis #400041
Minishaker MS1 IKA Works  MS1
Mikrotiterplatte Greiner Bio One #650101 96U
Enterotoxin SEB Sigma Aldrich S4881
DAPI Sigma Aldrich D9542 1:3000
CD3-PeTxR Invitrogen MHCD0317 1:30
Phalloidin-AF647 Molecular Probes A22287 1:150
IS100 Amnis Imaging flow cytometer
IDEAS Amnis Software
INSPIRE Amnis Software

References

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Cite This Article
Wabnitz, G., Kirchgessner, H., Samstag, Y. Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (143), e55345, doi:10.3791/55345 (2019).

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