इमेजिंग प्रवाह Cytometry का उपयोग कर मानव प्रणाली में प्रतिरक्षा Synapse के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण
Summary
यहां, हम प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं और प्रतिजन-पेश कोशिकाओं के बीच प्रतिरक्षा synapses के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक पूर्ण कार्यप्रवाह का वर्णन । विधि इमेजिंग फ्लो cytometry, जो समय की एक अपेक्षाकृत कम अवधि के भीतर अधिग्रहण और कई हजार सेल छवियों के मूल्यांकन की अनुमति देता है पर आधारित है ।
Abstract
प्रतिरक्षा synapse के बीच संचार का क्षेत्र है टी कोशिकाओं और प्रतिजन-पेश कोशिकाओं (APCs). टी कोशिकाओं सतह रिसेप्टर्स और प्रतिरक्षा synapse की दिशा में प्रोटीन का ध्रुवीकरण के लिए एक स्थिर बाध्यकारी और संकेत विनिमय आश्वासन देता हूं । शास्त्रीय फोकल, TIRF, या सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी प्रतिरक्षा synapse अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । चूंकि इन तरीकों मैनुअल छवि अधिग्रहण और समय लेने वाली ठहराव की आवश्यकता होती है, दुर्लभ घटनाओं की इमेजिंग चुनौतीपूर्ण है । यहाँ, हम एक कार्यप्रवाह है कि कोशिकाओं के हजारों के दसियों के रूपात्मक विश्लेषण में सक्षम बनाता है का वर्णन. इम्यून synapses को पैन-ल्युकोसैट तैयार करने में प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं के बीच प्रेरित किया जाता है और Staphylococcus aureus enterotoxin बी (एसईबी)-्ज् के रूप में भरी APCs कोशिकाएं. छवि अधिग्रहण इमेजिंग प्रवाह cytometry के साथ किया जाता है, में भी कहा जाता है प्रवाह माइक्रोस्कोपी, जो एक प्रवाह cytometer और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की सुविधाओं को जोड़ती है. टी सेल/APC जोड़ों की पहचान करने और प्रतिरक्षा synapses का विश्लेषण करने के लिए एक पूर्ण गेटिंग रणनीति प्रदान की जाती है । इस कार्यप्रवाह के रूप में शुद्ध पान-ल्युकोसैट की तैयारी में प्रतिरक्षा synapses के विश्लेषण की अनुमति देता है और इसलिए रक्त की केवल एक छोटी मात्रा (यानी, 1 मिलीलीटर) की आवश्यकता है, यह रोगियों से नमूनों के लिए लागू किया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात, कई नमूनों तैयार किया जा सकता है, मापा, और समानांतर में विश्लेषण ।
Introduction
टी कोशिकाओं अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के प्रमुख नियामकों रहे है और प्रतिजनी पेप्टाइड्स कि प्रमुख histocompatibility परिसरों (MHC) के संदर्भ में प्रस्तुत कर रहे है के माध्यम से सक्रिय कर रहे हैं । पूर्ण टी सेल सक्रियकरण दो संकेतों, प्रतिजन-विशिष्ट टी सेल रिसेप्टर (TCR)/CD3 जटिल और गौण रिसेप्टर्स के माध्यम से costimulatory संकेत के माध्यम क्षमता संकेत की आवश्यकता है । दोनों संकेतों प्रतिजन-पेश कोशिकाओं (APCs) के साथ टी कोशिकाओं की सीधी बातचीत के माध्यम से उत्पन्न कर रहे हैं । परिपक्व APCs MHC-पेप्टाइड परिसरों के माध्यम से टी-सेल सक्रियण के लिए क्षमता संकेत प्रदान करते हैं, और वे costimulatory लाइगैंडों व्यक्त (जैसे, CD80 या CD86) टी सेल सक्रियण1की प्रगति को आश्वस्त करने के लिए । costimulation का एक महत्वपूर्ण कार्य actin cytoskeleton2,3,4की पुनर्व्यवस्था है । cortical एफ actin टी कोशिकाओं आराम में अपेक्षाकृत स्थिर है । प्रतिजन-असर APCs के माध्यम से टी सेल उत्तेजना actin cytoskeleton की एक गहन पुनर्व्यवस्था की ओर जाता है । Actin गतिशीलता (यानी, फास्ट Actin बहुलकीकरण/depolymerization हलकों) टी कोशिकाओं को सक्षम बलों है कि प्रोटीन या organelles, उदाहरण के लिए परिवहन के लिए उपयोग किया जाता है बनाने के लिए । इसके अलावा, actin cytoskeleton टी कोशिकाओं और APCs के बीच एक विशेष संपर्क क्षेत्र के विकास के लिए महत्वपूर्ण है, प्रतिरक्षा synapse कहा जाता है । प्रतिरक्षा synapse के लिए actin cytoskeleton के महत्व के कारण, यह करने के लिए तरीकों का विकास आवश्यक हो गया है टी कोशिकाओं के actin cytoskeleton में परिवर्तन यों तो5,6,7,8 , 9.
actin cytoskeletal सहायता, सतह रिसेप्टर्स और संकेतन प्रोटीन के माध्यम से प्रतिरक्षा synapse के भीतर supramolecular सक्रियण क्लस्टर (SMACs) में अलग कर रहे हैं. प्रतिरक्षा synapse की स्थिरता रिसेप्टर्स के बंधन से एफ actin बंडलों कि actin cytoskeleton की लोच बढ़ाने के लिए आश्वासन दिया है । प्रतिरक्षा synapse गठन के लिए अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण होना दिखाया गया है । vivo में एक दोषपूर्ण प्रतिरक्षा synapse गठन के हानिकारक प्रभाव पहले Wiskott Aldrich सिंड्रोम से पीड़ित रोगियों में महसूस किया गया (था), एक रोग जिसमें actin बहुलकीकरण और, concomitantly, प्रतिरक्षा synapse गठन परेशान कर रहे हैं10 . रोगियों एक्जिमा, गंभीर आवर्तक संक्रमण, स्व-प्रतिरक्षित रोग, और melanomas से पीड़ित कर सकते हैं । इस खोज के बावजूद, यह वर्तमान में ज्ञात नहीं है कि प्रतिरक्षा synapse गठन स्वस्थ व्यक्तियों और प्रतिरक्षा दोष या स्व-प्रतिरक्षित रोगों से पीड़ित रोगियों की टी कोशिकाओं में अलग है ।
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सहित, फोकल, TIRF, और सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी, प्रतिरक्षा synapse11,12,13,14की वास्तुकला को उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया गया. इन प्रणालियों के उच्च संकल्प और लाइव सेल इमेजिंग प्रदर्शन की संभावना actin cytoskeleton और प्रतिरक्षा synapse में सतह या intracellular प्रोटीन के बारे में सटीक, spatio-लौकिक जानकारी के संग्रह में सक्षम बनाता है । कई परिणाम, तथापि, टी कोशिकाओं के केवल कुछ दसियों के विश्लेषण पर आधारित हैं । इसके अलावा, टी कोशिकाओं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के इन प्रकार के लिए शुद्ध किया जाना चाहिए । तथापि, कई शोध प्रश्नों के लिए, पतित कोशिकाओं के उपयोग के बजाय उच्चतम-संभव संकल्प अत्यंत महत्व का है । यह प्रासंगिक है अगर रोगियों से टी कोशिकाओं का विश्लेषण कर रहे हैं, के बाद से दान रक्त की मात्रा सीमित है और वहां के लिए समानांतर में कई नमूनों की प्रक्रिया की आवश्यकता हो सकती है ।
हम सूक्ष्म तरीके कि मानव प्रणाली में प्रतिरक्षा synapse में actin cytoskeleton के विश्लेषण की अनुमति की स्थापना की15,16,17। इन तरीकों इमेजिंग प्रवाह cytometry पर आधारित हैं, में भी कहा जाता है-प्रवाह माइक्रोस्कोपी18। multispectral प्रवाह cytometry और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के बीच एक संकर के रूप में, इमेजिंग प्रवाह cytometry रूपात्मक मापदंडों का विश्लेषण करने में अपनी ताकत है और विषम कोशिका आबादी में प्रोटीन स्थानीयकरण, जैसे पान-ल्यूकोसाइट्स से परिधीय रक्त । हम एक पद्धति है कि हमें टी में एफ actin-सेल/पूरे रक्त के नमूनों से मानव टी कोशिकाओं के APC conjugates, समय की जरूरत है और महंगा शुद्धीकरण कदम17की आवश्यकता के बिना सक्षम बनाता है शुरू की । यहां प्रस्तुत तकनीक पूरे कार्यप्रवाह शामिल है, प्रतिरक्षा synapse में एफ actin के ठहराव के लिए रक्त का नमूना प्राप्त करने से ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत कार्यप्रवाह मानव टी कोशिकाओं (पूर्व vivo) और APCs के बीच प्रतिरक्षा synapses के ठहराव को सक्षम करता है । विशेष रूप से, एरिथ्रोसाइट-लीजड ड पैन-ल्यूकोसाइट्स टी सेल सूत्रों के रूप में इस्तेमाल किया गया, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
काम जर्मन अनुसंधान परिषद द्वारा वित्त पोषित किया गया (DFG) अनुदान के साथ नहीं । SFB-९३८-M और SA 393/3-4 ।
Materials
| >Multifuge 3 SR | Heraeus | ||
| RPMI 1640 | LifeTechnologies | #11875085 | 500 mL |
| FCS | Pan Biotech#3302-P101102 | ||
| Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | #352054 | 5 mL |
| Kulturflasche | Thermo Scientific | #178883 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8662 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth | #8076.3 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | #16005 | |
| FACS Wash Saponin | PBS 1% BSA 0.15 Saponin | ||
| ReaktiosgefaB | Sarstedt | 72.699.002 | 0.5 mL |
| Speed Bead | Amnis | #400041 | |
| Minishaker MS1 | IKA Works | MS1 | |
| Mikrotiterplatte | Greiner Bio One | #650101 | 96U |
| Enterotoxin SEB | Sigma Aldrich | S4881 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 1:3000 |
| CD3-PeTxR | Invitrogen | MHCD0317 | 1:30 |
| Phalloidin-AF647 | Molecular Probes | A22287 | 1:150 |
| IS100 | Amnis | Imaging flow cytometer | |
| IDEAS | Amnis | Software | |
| INSPIRE | Amnis | Software |
References
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