ניתוחים כמותיים של הסינפסה המערכת החיסונית בגוף האדם באמצעות הדמיה Cytometry זרימה
Summary
כאן, אנו מתארים זרימת עבודה מלאה לניתוח כמותיים של המערכת החיסונית הסינפסות בין ראשי תאי T אנושיים תאים אנטיגן. השיטה מבוססת על מיכשור הדמיה, אשר מאפשר רכישת הערכה של מספר תאים אלף תמונות בתוך תקופה קצרה יחסית של זמן.
Abstract
הסינפסה החיסון הוא האזור של תקשורת בין תאי T, תאים אנטיגן (נגמ שים). תאי T polarize רצפטורים משטח וחלבונים לכיוון הסינפסה המערכת החיסונית כדי להבטיח איגוד יציב אות exchange. מיקרוסקופ קונפוקלי, TIRF או רזולוציה סופר קלאסי שימשו ללמוד הסינפסה המערכת החיסונית. מאז שיטות אלו דורשות ייבוא תמונות ידנית, כימות גוזלת זמן, ההדמיה של מאורעות נדירים הוא מאתגר. כאן, אנו מתארים זרימת עבודה המאפשרת ניתוח מורפולוגי של עשרות אלפי תאים. הסינפסות המערכת החיסונית הם המושרה בין ראשי בתאי T אנושיים בהכנות פאן-ליקוציט Staphylococcus aureus enterotoxin ראג’י טעון-B SEB תאים כמו נגמ שים. ייבוא תמונות מתבצע באמצעות הדמיה cytometry זרימה, הנקרא גם בזרימה מיקרוסקופ, המשלבת תכונות של cytometer זרימה של מיקרוסקופ זריחה. אסטרטגיה חסימה מלאה לזוגות תא T/APC ואבחון הסינפסות החיסון הינו מסופק. כאשר זרימת עבודה זו מאפשרת הניתוח של החיסון synapses בהכנות ולזרימה פאן-ליקוציט ודורש ומכאן רק נפח קטן של דם (קרי, 1 מ”ל), ניתן להחיל אותה על דגימות מחולים. חשוב לציין, מספר דגימות מוכן, ולהשוואה ניתח במקביל.
Introduction
תאי T הרגולטורים העיקריים של מערכת החיסון מסתגלת, מופעלים באמצעות פפטידים antigenic המוצגים בהקשר של מתחמי histocompatibility הגדולות (MHC). הפעלה מלאה של תא T דורש שני אותות, האות כשירות באמצעות הקולטן תא T אנטיגן ספציפי (TCR) / CD3 מתחם, האות costimulatory באמצעות קולטנים אביזר. שני אותות שנוצרו באמצעות האינטראקציה הישירה של תאי T עם אנטיגן תאים (נגמ שים). נגמ שים בוגרים מספקים את האות מיומנות להפעלת T-cell דרך MHC-פפטיד מתחמי, הם מבטאים ליגנדים costimulatory (למשל, CD80 או CD86) כדי להבטיח את ההתקדמות של T-cell הפעלה1. פונקציה חשובה אחת של costimulation היא התארגנות מחודשת של3,42,שלד התא אקטין. בקליפת המוח F-אקטין היא סטטית יחסית ב נח בתאי T. תא T גירוי דרך מניבי אנטיגן נגמ שים מוביל שחלוף עמוקה של שלד התא אקטין. אקטין דינמיקה (קרי, אקטין מהר פלמור/depolymerization מעגלים) מאפשרים תאי T ליצור כוחות אשר משמשים להעברת חלבונים או organelles, למשל. יתר על כן, שלד התא אקטין חשוב לפיתוח אזור קשר מיוחד בין תאי T נגמ שים, שנקרא הסינפסה המערכת החיסונית. בשל חשיבות שלד התא אקטין את הסינפסה המערכת החיסונית, זה הפך חיוני לפתח שיטות כדי לכמת שלד התא אקטין של T תאים5,6,7,8 שינויים , 9.
על-ידי סיוע cytoskeletal אקטין, קולטנים משטח וחלבונים איתות מובדלים באשכולות הפעלה סופרא מולקולרית (SMACs) בתוך הסינפסה המערכת החיסונית. היציבות של הסינפסה המערכת החיסונית מובטחת על ידי קשירה של קולטני חבילות F-אקטין המגבירים את האלסטיות של שלד התא אקטין. היווצרות סינפסה החיסון הוכח להיות קריטית עבור הדור של ההיענויות החיסון מסתגלת. השפעות מזיקות של צורה פגומה סינפסה המערכת החיסונית ויוו התממשו קודם בחולים הסובלים מ תסמונת אולדריץ ויסקוט (WAS), מחלה אשר פלמור אקטין, / ת, נגרמת הפרעה היווצרות מערכת החיסון סינפסה10 . היה מטופלים עלולים לסבול אקזמה, דלקות חוזרות ונשנות חמורים, מחלות אוטואימוניות, מלנומה. למרות ממצא זה, כרגע לא ידוע אם המערכת החיסונית סינפסה היווצרות שונה בתאי T אנשים בריאים וחולים הסובלים החיסון מולדים או מחלות אוטואימוניות.
מיקרוסקופ פלורסצנטיות, כולל וידאו, TIRF, סופר-רזולוציה מיקרוסקופ, שימשו לגלות את הארכיטקטורה המערכת החיסונית סינפסה11,12,13,14. הרזולוציה הגבוהה של מערכות אלה ועל האפשרות של ביצוע הדמיה לחיות תאים מאפשרת איסוף מידע מדויק, -עתיים על שלד התא של אקטין, פני שטח או תאיים חלבונים ב הסינפסה המערכת החיסונית. עם זאת, תוצאות רבות, מבוססות על ניתוח רק כמה עשרות תאי T. יתר על כן, תאי T חייבים להיטהר עבור סוגים אלה של קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. עבור שאלות מחקר רבות, השימוש של תאים ולזרימה ולא את הרזולוציה הגבוהה ביותר-האפשר זאת, חשיבות עליונה. זה רלוונטי אם T תאים מחולים מנותחים, שכן כמות הדם שנתרמו מוגבל, ייתכן שיש צורך לעבד דוגמאות רבות במקביל.
הקמנו שיטות מיקרוסקופיים לאפשר הניתוח של שלד התא אקטין ב הסינפסה מחוסן16,15,המערכת האנושית17. שיטות אלה מבוססות על הדמיה cytometry זרימה, הנקרא גם בזרימה מיקרוסקופ18. כמו הכלאה בין זרימה מולטי ספקטריאליות cytometry, קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, הדמיה cytometry זרימה יש הייתרונות בניתוח מורפולוגי פרמטרים ולוקליזציה חלבון באוכלוסיות הטרוגניות התא, כגון פאן-לויקוציטים מ דם היקפיים. הצגנו מתודולוגיה המאפשרת לנו לכמת F-אקטין ב- T-תא/APC conjugates של תאים אנושיים T מדגימות דם מלא, ללא צורך זמן רב ויקרות טיהור צעדים17. הטכניקה המובאת כאן כוללת כל זרימת העבודה, מלקבל את דגימת הדם על כימות של F-אקטין ב הסינפסה המערכת החיסונית.
Protocol
Representative Results
Discussion
זרימת העבודה המוצגת כאן מאפשר כימות של המערכת החיסונית הסינפסות. בין תאי T אנושיים (ex-vivo) נגמ שים. ראוי לציין, פן כדוריות דם אדומות-lysed-לויקוציטים שימשו כמקורות T-cell, ביצוע פעולות טיהור T-cell לוותר. הקו תא B-cell לימפומה ראג’י שימש הפונדקאית נגמ שים. זה נושא יתרונות משמעותיים, שכן הוא מאפשר השוואות ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה מומן על ידי המועצה למחקר גרמני (DFG) עם מענקים לא. SFB-938-M ו- SA 393/3-4.
Materials
| >Multifuge 3 SR | Heraeus | ||
| RPMI 1640 | LifeTechnologies | #11875085 | 500 mL |
| FCS | Pan Biotech#3302-P101102 | ||
| Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | #352054 | 5 mL |
| Kulturflasche | Thermo Scientific | #178883 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8662 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth | #8076.3 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | #16005 | |
| FACS Wash Saponin | PBS 1% BSA 0.15 Saponin | ||
| ReaktiosgefaB | Sarstedt | 72.699.002 | 0.5 mL |
| Speed Bead | Amnis | #400041 | |
| Minishaker MS1 | IKA Works | MS1 | |
| Mikrotiterplatte | Greiner Bio One | #650101 | 96U |
| Enterotoxin SEB | Sigma Aldrich | S4881 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 1:3000 |
| CD3-PeTxR | Invitrogen | MHCD0317 | 1:30 |
| Phalloidin-AF647 | Molecular Probes | A22287 | 1:150 |
| IS100 | Amnis | Imaging flow cytometer | |
| IDEAS | Amnis | Software | |
| INSPIRE | Amnis | Software |
References
- Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
- Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
- Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
- Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68 (2016).
- Piragyte, I., Jun, C. D. Actin engine in immunological synapse. Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).
- Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. Super-resolution microscopy of the immunological synapse. Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
- Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
- Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421 (2012).
- Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
- Basiji, D., O’Gorman, M. R. Imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).
- Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
- Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
- Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
