Kvalitativ og kvantitativ analyse af den immun Synapse i det menneskelige System, ved hjælp af Imaging flowcytometri
Summary
Her beskriver vi et komplet arbejdsgang for den kvalitative og kvantitative analyser af immun synapser mellem primære humane T celler og antigen-præsenterer celler. Metoden er baseret på imaging flowcytometri, som giver mulighed for erhvervelse og evaluering af flere tusinde celle billeder inden for en relativt kort periode.
Abstract
Den immun synapse er inden for kommunikation mellem T-celler og antigen-præsentere celler (PMV’er). T-celler polarisere overflade receptorer og proteiner mod den immun synapse til at sikre en stabil bindende og signalere exchange. Klassisk Konfokal, JOHANNAS eller Super-resolution mikroskopi er blevet brugt til at studere den immun synapse. Da disse metoder kræver manuel billede erhvervelse og tidskrævende kvantificering, er billeddannelse af sjældne begivenheder udfordrende. Her, beskriver vi en arbejdsproces, som gør det muligt for den morfologisk analyse af titusinder af celler. Immun synapser er induceret mellem primære human T-celler i pan-leukocyt præparater og Staphylococcus aureus enterotoksin B SEB-loaded Raji celler som pansrede mandskabsvogne. Billede erhvervelse er udført med imaging flowcytometri, også kaldet In-Flow mikroskopi, som kombinerer funktionerne af et flow forskellige og et fluorescens mikroskop. Der tilbydes en komplet gating strategi til at identificere T-celle/APC par og analysere de immun synapser. Da denne arbejdsproces giver mulighed for analyse af immun synapser i urenset pan-leukocyt præparater og dermed kræver kun en lille mængde blod (dvs., 1 mL), det kan anvendes på prøver fra patienter. Vigtigere, kan flere prøver være forberedt, målt og analyseret i parallel.
Introduction
T-celler er store regulatorer af den adaptive immunsystem og er aktiveret gennem antigene peptider, der præsenteres i forbindelse med store histocompatibility komplekser (MHC). Fuld T-celle aktivering kræver to signaler, det kompetence signal via antigen-specifikke T-celle receptoren (TCR) / CD3 komplekset og den costimulatory signal via tilbehør receptorer. Begge signaler der genereres gennem direkte samspillet mellem T-celler og antigen-præsentere celler (PMV’er). Modne PMV’er give kompetence signal for T-celle aktivering via MHC-peptid komplekser, og de udtrykker costimulatory ligander (f.eks., CD80 eller CD86) til at sikre progression af T-celle aktivering1. En vigtig funktion af costimulation er omlejring af actin cytoskeleton2,3,4. Den kortikale F-actin er relativt statiske i hvile T-celler. T-celle stimulering gennem antigen-bærende PMV’er fører til en gennemgribende omlægning af actin cytoskelet. Aktin dynamics (dvs., hurtig actin polymerisering/depolymerization kredse) aktiverer T-celler til at oprette kræfter, der bruges til at transportere proteiner eller organeller, f.eks. Derudover er actin cytoskelettet vigtigt for at udvikle en særlig kontakt zone mellem T-celler og pansrede mandskabsvogne, kaldet immun synapse. På grund af betydningen af actin cytoskelettet til immun synapse, er det blevet vigtigt at udvikle metoder til at kvantificere ændringer i actin cytoskelettet T celler5,6,7,8 , 9.
Ved hjælp af actin cytoskeletal støtte, er overflade receptorer og signalering proteiner adskilles i Supramolekylær aktivering klynger (SMACs) inden for den immun synapse. Stabiliteten i den immun synapse er sikret ved binding af receptorer til F-actin bundter, at øger elasticiteten i actin cytoskelet. Immun synapse dannelse har vist sig at være afgørende for generation af de adaptive immunrespons. De skadelige effekter af en defekt immun synapse formation in vivo blev først realiseret i patienter, der lider fra Wiskott Aldrich syndrom (WAS), en sygdom i hvilken actin polymerisation og samtidig, immun synapse dannelse er forstyrret10 . VAR patienter kan lider af eksem, alvorlige tilbagevendende infektioner, autoimmune sygdomme og melanomer. Trods denne konstatering, er det i øjeblikket ikke kendt om immun synapse dannelse afviger i T-celler af raske personer og patienter med immun-defekter eller autoimmune sygdomme.
Fluorescens mikroskopi, herunder Konfokal, JOHANNAS og super-resolution mikroskopi, blev brugt til at afdække arkitekturen i immun synapse11,12,13,14. Den høje opløsning af disse systemer og mulighed for at udføre live-celle imaging muliggør indsamling af nøjagtige, spatio-temporale oplysninger om actin cytoskelettet og overflade eller intracellulære proteiner i immun synapse. Mange resultater, men er baseret på analyse af kun et par snese T-celler. Derudover skal T celler renses for disse typer af Fluorescens mikroskopi. Men for mange forskningsspørgsmål, brugen af urenset celler i stedet for den højest mulige opløsning er af allerstørste betydning. Dette er relevant, hvis T-celler fra patienter er analyseret, da mængden af donorblod er begrænset og der kan være behov for at behandle mange prøver parallelt.
Vi etablerede mikroskopiske metoder, der giver mulighed for analyse af actin cytoskelettet i immun synapse i menneskelige system15,16,17. Disse metoder er baseret på imaging flowcytometri, også kaldet In-Flow mikroskopi18. Som en hybrid mellem multispektrale flow flowcytometri og Fluorescens mikroskopi, imaging flowcytometri har sine styrker i analyse af morfologiske parametre og protein lokalisering i heterogene cellepopulationer, såsom pan-leukocytter fra den perifert blod. Vi indførte en metode, der gør det muligt at kvantificere F-actin i T-celle/APC konjugater af humane T celler fra fuldblod prøver, uden behovet for tidskrævende og dyrt rensning trin17. Teknikken præsenteret her omfatter den hele arbejdsproces fra at få blodprøve til kvantificering af F-actin i immun synapse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Arbejdsprocessen præsenteres her giver mulighed for kvantificering af immun synapser mellem human T-celler (ex vivo) og pansrede mandskabsvogne. Navnlig blev erytrocyt-mængden pan-leukocytter brugt som T-celle kilder, hvilket gør T-celle rensning trin undværes. B-celle lymfom cellelinie Raji fungerede som surrogat pansrede mandskabsvogne. Dette bærer betydelige fordele, da det giver mulighed for sammenligninger mellem bloddonorer af T-celle side af den immun synapse. Derudover er autolog DCs næppe tilgængelige dir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet blev finansieret af den tyske Forskningsråd (DFG) med tilskud. SFB-938-M og SA 393/3-4.
Materials
| >Multifuge 3 SR | Heraeus | ||
| RPMI 1640 | LifeTechnologies | #11875085 | 500 mL |
| FCS | Pan Biotech#3302-P101102 | ||
| Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | #352054 | 5 mL |
| Kulturflasche | Thermo Scientific | #178883 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8662 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth | #8076.3 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | #16005 | |
| FACS Wash Saponin | PBS 1% BSA 0.15 Saponin | ||
| ReaktiosgefaB | Sarstedt | 72.699.002 | 0.5 mL |
| Speed Bead | Amnis | #400041 | |
| Minishaker MS1 | IKA Works | MS1 | |
| Mikrotiterplatte | Greiner Bio One | #650101 | 96U |
| Enterotoxin SEB | Sigma Aldrich | S4881 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 1:3000 |
| CD3-PeTxR | Invitrogen | MHCD0317 | 1:30 |
| Phalloidin-AF647 | Molecular Probes | A22287 | 1:150 |
| IS100 | Amnis | Imaging flow cytometer | |
| IDEAS | Amnis | Software | |
| INSPIRE | Amnis | Software |
References
- Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
- Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
- Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
- Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68 (2016).
- Piragyte, I., Jun, C. D. Actin engine in immunological synapse. Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).
- Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. Super-resolution microscopy of the immunological synapse. Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
- Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
- Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421 (2012).
- Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
- Basiji, D., O’Gorman, M. R. Imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).
- Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
- Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
- Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
