影像性流式细胞仪对人体免疫突触的定性和定量分析
Summary
在这里, 我们描述了一个完整的工作流程, 用于定性和定量分析免疫突触之间的原代人类 t 细胞和抗原呈现细胞。该方法基于成像流式细胞仪, 允许在相对较短的时间内采集和评估数千张细胞图像。
Abstract
免疫突触是 t 细胞与抗原表达细胞 (apc) 之间的交流区域。t 细胞将表面受体和蛋白质向免疫突触极化, 以确保稳定的结合和信号交换。经典共聚焦、tirf 或超分辨显微镜已被用于研究免疫突触。由于这些方法需要手动图像采集和耗时的量化, 因此对罕见事件的成像具有挑战性。在这里, 我们描述了一个工作流, 它可以对数万个单元格进行形态分析。泛白细胞制剂中的原代人 t 细胞与负载为 apc的金黄色葡萄球菌肠毒素 b (seb) 之间诱导免疫突触。图像采集是通过成像流式细胞仪 (也称为流内显微镜) 进行的, 它结合了流式细胞仪和荧光显微镜的特征。为识别 t 细胞 apc 夫妇和分析免疫突触提供了一种完整的门控策略。由于此工作流程允许分析未纯化的泛白细胞制剂中的免疫突触, 因此只需要少量血液 (即1毫升),因此它可以应用于患者的样本。重要的是, 可以同时制备、测量和分析多个样品。
Introduction
t 细胞是自适应免疫系统的主要调节剂, 并通过抗原肽激活, 这些肽是在主要组织相容性复合物 (mhc) 的背景下出现的。全 t 细胞激活需要两个信号, 即通过抗原特异性 t 细胞受体 (TCR)/CD3 复合体的能力信号和通过辅助受体的共刺激信号。这两个信号都是通过 t 细胞与抗原呈现细胞 (apc) 的直接相互作用产生的。成熟的 apc 通过 mhc-肽复合物提供 t 细胞活化的能力信号, 它们表达共刺激配体 (如 cd80 或 cd86), 以确保 t 细胞活化1的进展.共刺激的一个重要功能是重新排列肌动蛋白细胞骨架2,3,4。在静止 t 细胞中, 皮质 f-肌动蛋白相对静态。通过抗原性 apc 刺激 t 细胞导致肌动蛋白细胞骨架的深刻重排。肌动蛋白动力学 (即快速活性蛋白聚合/解聚合圈) 使 t 细胞产生的力量, 用于运输蛋白质或细胞器, 例如。此外, 肌动蛋白细胞骨架是重要的发展一个特殊的接触区之间的 t 细胞和 apc, 称为免疫突触。由于肌动蛋白细胞骨架对免疫突触的重要性, 因此有必要开发一些方法来量化 t 细胞 5、6、7、8的肌动蛋白细胞骨架的变化,9个。
通过肌动蛋白细胞骨架辅助, 表面受体和信号蛋白在免疫突触内的超分子激活簇 (smac) 中分离。免疫突触的稳定性是由受体结合到 f-肌动蛋白束, 增加肌动蛋白细胞骨架的弹性。免疫突触的形成已经被证明是产生适应性免疫反应的关键。在患有 wiskott aldrich 综合征 (was) 的患者中, 首次意识到体内免疫突触形成有缺陷的有害影响, 在这种疾病中, 肌动蛋白聚合和同时免疫突触的形成受到干扰.was 患者可能患有湿疹、严重的反复感染、自身免疫性疾病和黑色素瘤。尽管有这一发现, 但目前尚不清楚免疫突触的形成在患有免疫缺陷或自身免疫性疾病的健康个体和患者的 t 细胞中是否不同。
荧光显微镜, 包括共聚焦、tirf 和超分辨率显微镜, 被用来揭示免疫突触 11,12,13,14的结构。这些系统的高分辨率和进行活细胞成像的可能性使得能够收集关于免疫突触中的肌动蛋白细胞骨架和表面或细胞内蛋白质的精确时空信息。然而, 许多结果是基于对几十种 t 细胞的分析。此外, 对于这些类型的荧光显微镜, t 细胞必须纯化。然而, 对于许多研究问题来说, 使用未纯化的细胞而不是尽可能高的分辨率至关重要。如果对患者的 t 细胞进行分析, 这一点是相关的, 因为捐献的血液数量有限, 可能需要同时处理许多样本。
我们建立了微观方法, 可以分析人类系统免疫突触中的肌动蛋白细胞骨架 15、16、17。这些方法是基于成像流式细胞仪, 也称为流内显微镜18。作为多光谱流式细胞仪和荧光显微镜的混合体, 成像流式细胞仪在分析非均质细胞群 (如泛白细胞) 的形态参数和蛋白质定位方面具有优势。外周血。我们引入了一种方法, 使我们能够量化从全血样本的人 t 细胞的 t-cele® apc 结合中的 f-肌动蛋白, 而不需要耗时和昂贵的纯化步骤17。这里介绍的技术包括整个工作流程, 从获得血液样本到免疫突触中 f-肌动蛋白的定量。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里介绍的工作流程使人的 t 细胞 (体外) 和 apc 之间的免疫突触能够进行量化。值得注意的是, 红细胞裂解泛白细胞被用作 t 细胞源, 使 t 细胞纯化步骤成为可有可无的。b 细胞淋巴瘤细胞系拉吉作为代理 apc。这具有显著的优势, 因为它允许免疫突触 t 细胞侧的献血者进行比较。此外, 自体 dc 很难直接从人体外周血中获得。单核细胞衍生树突状细胞 (modc) 的产生需要几天时间, 这使得其在临床研究中…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作由德国研究委员会 (dfg) 提供资金, 并提供第1号赠款。sfb-938-m 和 sa 393-4。
Materials
| >Multifuge 3 SR | Heraeus | ||
| RPMI 1640 | LifeTechnologies | #11875085 | 500 mL |
| FCS | Pan Biotech#3302-P101102 | ||
| Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | #352054 | 5 mL |
| Kulturflasche | Thermo Scientific | #178883 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8662 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth | #8076.3 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | #16005 | |
| FACS Wash Saponin | PBS 1% BSA 0.15 Saponin | ||
| ReaktiosgefaB | Sarstedt | 72.699.002 | 0.5 mL |
| Speed Bead | Amnis | #400041 | |
| Minishaker MS1 | IKA Works | MS1 | |
| Mikrotiterplatte | Greiner Bio One | #650101 | 96U |
| Enterotoxin SEB | Sigma Aldrich | S4881 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 1:3000 |
| CD3-PeTxR | Invitrogen | MHCD0317 | 1:30 |
| Phalloidin-AF647 | Molecular Probes | A22287 | 1:150 |
| IS100 | Amnis | Imaging flow cytometer | |
| IDEAS | Amnis | Software | |
| INSPIRE | Amnis | Software |
References
- Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
- Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
- Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
- Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68 (2016).
- Piragyte, I., Jun, C. D. Actin engine in immunological synapse. Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).
- Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. Super-resolution microscopy of the immunological synapse. Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
- Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
- Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421 (2012).
- Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
- Basiji, D., O’Gorman, M. R. Imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).
- Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
- Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
- Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
