Summary

Análise qualitativa e quantitativa de sinapse imunológica no sistema humano usando a imagem latente de citometria de fluxo

Published: January 07, 2019
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Summary

Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho completo para a análise qualitativa e quantitativa das sinapses imunes entre primárias células T humanas e células apresentadoras de antígeno. O método baseia-se na imagem citometria de fluxo, que permite a aquisição e a avaliação de várias imagens de milhares de células dentro de um período relativamente curto de tempo.

Abstract

A sinapse imunológica é a área de comunicação entre as células T e células apresentadoras de antígeno (APCs). Células T polarizar a receptores de superfície e proteínas para a sinapse imunológica para assegurar uma ligação estável e troca o sinal. Microscopia confocal, TIRF ou super-resolução clássica têm sido utilizados para estudar a sinapse imunológica. Uma vez que esses métodos exigem a aquisição de imagem manual e quantificação demorada, a imagem de eventos raros é um desafio. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho que permite a análise morfológica de dezenas de milhares de células. Imune as sinapses são induzidas entre as células T humanas primárias em preparações de panleucócitos e as células Raji B SEB-carregado de enterotoxina Staphylococcus aureus como APCs. Aquisição de imagens é realizada com imaging citometria de fluxo, também chamada de microscopia em fluxo, que combina características de um citômetro de fluxo e um microscópio de fluorescência. Uma estratégia completa associada para identificar a célula T/APC casais e analisando as sinapses imunes é fornecida. Como esse fluxo de trabalho permite a análise de imune sinapses nos preparativos do panleucócitos impuro e, portanto, requer apenas um pequeno volume de sangue (ou seja,, 1 mL), pode ser aplicado a amostras de pacientes. Importante, várias amostras podem ser preparadas, medidas e analisadas em paralelo.

Introduction

As células T são importantes reguladores do sistema imune adaptativo e são ativadas através de peptídeos antigênicos que são apresentados no contexto dos complexos de histocompatibilidade (MHC). Ativação de células T completa requer dois sinais, o sinal de competência através do receptor de células T antígeno-específicos (TCR) / CD3 complexo e o sinal de co-estimulação via receptores acessórios. Ambos os sinais são gerados através da interação direta de células T com apresentadoras células (APCs). APCs maduros fornecem o sinal de competência para a ativação de células T através dos complexos peptídeo-MHC, e expressam a co-estimulação ligantes (por exemplo,, CD80 ou CD86) para garantir a progressão da ativação de células T1. Uma função importante de costimulation é o rearranjo do citoesqueleto de actina2,3,4. A F-Actina cortical é relativamente estática no repouso de células T. Estimulação de células T através do antígeno-rolamento APCs leva a uma profunda reorganização do citoesqueleto de actina. Dinâmica de actina (ou seja,, actina rápida polimerização/despolimerização círculos) permite que as células T criar as forças que são usadas para o transporte de proteínas ou organelas, por exemplo. Além disso, o citoesqueleto de actina é importante para o desenvolvimento de uma zona especial de contato entre as células T e APCs, chamados de sinapse imunológica. Devido à importância do citoesqueleto de actina para o sinapse imunológica, tornou-se essencial desenvolver métodos para quantificar alterações do citoesqueleto de actina de T células5,6,7,8 , 9.

Através da ajuda do citoesqueleto de actina, receptores de superfície e proteínas de sinalização são segregadas em clusters de activação supramoleculares (SMACs) dentro da sinapse imunológica. A estabilidade da sinapse imunológica é assegurada pela ligação dos receptores para pacotes de F-Actina que aumentam a elasticidade do citoesqueleto de actina. Formação de sinapse imunológica foi mostrada para ser crítico para a geração das respostas imune adaptativas. Os efeitos nocivos de uma formação de sinapse imune defeituoso em vivo primeiro foram realizados em pacientes que sofrem de Wiskott Aldrich síndrome (WAS), uma doença na qual polimerização da actina e, concomitantemente, a formação de sinapse imunológica são perturbados10 . FOI de pacientes podem sofrer de eczema, infecções recorrentes graves, doenças auto-imunes e melanomas. Apesar desta constatação, atualmente não se sabe se a formação de sinapse imunológica diferente nas células T de indivíduos saudáveis e pacientes que sofrem de defeitos imunes ou doenças auto-imunes.

Microscopia de fluorescência, incluindo confocal, TIRF e microscopia de super-resolução, foram usados para descobrir a arquitectura do sinapse imunológica11,12,13,14. A alta resolução desses sistemas e a possibilidade de realização de imagem latente da viver-pilha permite a recolha de informações exatas, espaço-temporais sobre o citoesqueleto de actina e proteínas intracelulares ou superfície na sinapse imunológica. Muitos resultados, no entanto, baseiam-se na análise de apenas algumas dezenas de células T. Além disso, as células T devem ser purificadas para estes tipos de microscopia de fluorescência. No entanto, para muitas perguntas de pesquisa, o uso de células impuro, ao invés da resolução mais alta possível é de extrema importância. É relevante se as células T de pacientes são analisadas, desde que a quantidade de sangue doado é limitada e pode haver a necessidade de processar muitas amostras em paralelo.

Nós estabelecemos métodos microscópicos que permitem a análise do citoesqueleto de actina na sinapse imunológica no sistema humano15,16,17. Estes métodos baseiam-se na imagem de citometria de fluxo, também chamada de fluxo em microscopia18. Como um híbrido entre multiespectrais fluxo cytometry e fluorescência microscopia, citometria de fluxo de imagem tem seus pontos fortes na análise de parâmetros morfológicos e a localização da proteína em populações de células heterogêneas, tais como panleucócitos do sangue periférico. Introduzimos uma metodologia que nos permite quantificar a F-Actina em conjugados de T-celular/APC de células T humanas de amostras de sangue total, sem a necessidade de etapas de purificação demorada e dispendiosa17. A técnica aqui apresentada compreende o fluxo de trabalho inteiro, de obter a amostra de sangue para a quantificação de F-Actina na sinapse imunológica.

Protocol

1. preparação do Panleucócitos Empate 1 mL de sangue periférico de um doador saudável (ou paciente) em uma seringa heparinizada. Certifique-se de ter a aprovação pelo Comitê de ética responsável para a doação de sangue. Misturar 1 mL de periférico humano com 30 mL de tampão de Lise ACK (150mm NH4Cl, 1mm KHCO3e 0,1 mM EDTA, pH 7,0) em um tubo de 50 mL de sangue e incubar durante 8 min à temperatura ambiente. Encha os tubos com PBS e centrifugar x 300 g…

Representative Results

Dos principais objetivos do método descrito aqui é a quantificação do enriquecimento de proteína (por exemplo,, F-Actina) na sinapse imunológica entre APCs (células Raji) e células T em panleucócitos impuro, tomadas de amostras de sangue humano de baixo volume (1ml) de aluguel. A captura de tela na Figura 1 dá uma visão geral da estratégia associada da crítica desse método. Ele mostra a Galeria de imagens na esquerda e a área de análise à direita…

Discussion

O fluxo de trabalho apresentado aqui permite a quantificação de imunes sinapses entre as células T humanas (ex vivo) e APCs. Notavelmente, eritrócitos-lysed panleucócitos foram usados como fontes de células T, tornando as etapas de purificação de células T dispensável. A linhagem de células de linfoma de célula B Ribeiro serviu como substituto APCs. Isto traz vantagens significativas, uma vez que permite comparações entre doadores de sangue do lado da sinapse imunológica de célula T. Além disso, a DCs au…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O trabalho foi financiado pelo Conselho de pesquisa alemã (DFG) com subsídios não. SFB-938-M e SA 393/3-4.

Materials

>Multifuge 3 SR Heraeus
RPMI 1640 LifeTechnologies #11875085 500 mL
FCS Pan Biotech#3302-P101102
Polystyrene Round Bottom Tube Falcon #352054 5 mL
Kulturflasche Thermo Scientific #178883
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma D8662
Bovine Serum Albumin Roth #8076.3
Saponin Sigma S7900
Paraformaldehyde Sigma Aldrich #16005
FACS Wash Saponin PBS 1% BSA 0.15 Saponin
ReaktiosgefaB Sarstedt 72.699.002 0.5 mL
Speed Bead Amnis #400041
Minishaker MS1 IKA Works  MS1
Mikrotiterplatte Greiner Bio One #650101 96U
Enterotoxin SEB Sigma Aldrich S4881
DAPI Sigma Aldrich D9542 1:3000
CD3-PeTxR Invitrogen MHCD0317 1:30
Phalloidin-AF647 Molecular Probes A22287 1:150
IS100 Amnis Imaging flow cytometer
IDEAS Amnis Software
INSPIRE Amnis Software

References

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Cite This Article
Wabnitz, G., Kirchgessner, H., Samstag, Y. Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (143), e55345, doi:10.3791/55345 (2019).

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